左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究【精品分享】

左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究【精品分享】 左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质 激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究 作者,姚建平,金国琴,戴薇薇,姚龄爱,康湘萍 【摘要】 目的观察老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素,CRH)表 达和血清皮质酮,CORT)含量变化和左归丸、右归丸对其的影响,探索老年肾 虚大鼠CRH多肽表达与下丘脑-垂体-肾上腺皮质,HPA)轴活性的相关性及左归 丸和右归丸的作用。方法以自然衰老SD雄性大鼠,24月龄,为肾虚衰老模型, 大鼠随机分为老年对照组、左归丸组和右归丸组,每组35只,另设青年对照组 (5月龄,35只,共4组。老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。左、右归丸组 大鼠自20月龄始,均按相当于左、右归丸生药7. 5g • kg-1 (成人临床用量的 15倍,自由饮用稀释药液,每周停药2 d,连续4个月,采用Western Blot检 测大鼠杏仁核CRH多肽表达,放免检测血清C0RT含量。结果与青年对照组比较, 老年对照组大鼠杏仁核CRH多肽表达及血清C0RT含量显著增高,PC0.05),与 老年对照组相比,左归丸组及右归丸组大鼠杏仁核CRH多肽表达及血清C0RT含 量显著下降,P〈0.05)。结论左归丸、右归丸通过调节杏仁核CRH多肽表达 进而调节衰老大鼠HPA轴功能。 【关键词】促肾上腺皮质激素释放激素,肾虚,左归丸,右归丸 下丘脑-垂体-肾上腺皮质,HPA)轴是重要的神经内分泌调节系统之一,与 衰老密切相关。下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素,CRH)对HPA轴发挥 主要调节作用。近年研究表明,杏仁核也存在高表达的CRH,杏仁核可以通过 CRH能神经元直接作用于下丘脑,促进HPA轴活性[1],提示杏仁核参与HPA 轴调节,协同维持HPA轴的神经内分泌稳态调控水平。本实验以自然衰老大鼠 为肾虚衰老模型,探索杏仁核CRH表达与HPA轴功能调节的相关性及左归丸、 右归丸的作用。 1材料与仪器 1.1 动物雄性Sprauge-Dawley (SD)大鼠,清洁级,上海中医药大学 实验动物中心提供,动物许可证号,2003-0002。 1. 2 试剂兔抗鼠CRH多克隆抗体,武汉博士德生物技术有限公司,,大 鼠皮质酮放免检测试剂盒，Diagnostic Systems Laboratories, Inc),中药 (饮片,。 _1.3 仪器垂直电泳及电转移装置,Bio-Rad Company) , Y 射线计数仪 (Beckman Company)。 2方法 2.1 动物分组、造模与给药105只SD雄性大鼠,随机分为3组,老年 对照组、左归丸组、右归丸组,每组35只。另设青年对照组35只,共4组。 温度18?22?C,光暗周期12 h , 12 h,群养,5只/笼,常规喂养饲料,自由 饮水。以自然衰老SD雄性大鼠,24月龄,为模型,老年对照组大鼠常规喂养 至24月龄。左、右归丸组大鼠从20月龄始,均按左、右归丸生药7. 5 g • kg- 1 (相当成人临床用量的15倍,自由饮用稀释药液,每周停药两天,连续4个 月。 2. 2 药材及制剂左、右归丸组方及用量均参照《方剂学》第1版教材, 原方用量,单位,g)左归丸,熟地24,山药12,枸杞子12,山茱萸12,川牛 膝9,菟丝子12,鹿角胶12,龟甲12, 右归丸,熟地24,山药12,山茱萸 ,鹿角胶12,炒杜仲12,当归9,肉桂6,炮附 9,拘杞子9,菟丝子12 子6。中药,饮片,一次性购于上海华宇药业有限公司,两方均按原方用量比 例水煎,浓缩成膏,-30?C保存。 2.3取材 大鼠腹腔麻醉,25%乌拉坦,0.75 mg/kg),用消毒手术器械取大鼠杏仁核, 置于高压蒸气灭菌的Eppendorf管中,-70?C保存。 2. 4 Western Blot法检测大鼠杏仁核CRH多肽表达 蛋白样品制备,称取样品100 mg放入消毒处理试管一加入RIPA 900 |J 1, 冰浴匀浆一匀浆后立即加入100 M 1 PMSF(100 M g/ml)液一转移到1. 5 ml离 心管中并加 40 |J 1 (10|J g/|J 1) Complete 液一4?C,10 000 r . min-1,离心 10 min—取上清液,-70?C冻存一24 h 后,4?C,10 000 r/min,离心 10 min— 取上清,分装,-70?C保存待测,蛋白样品浓度检测,参考马斯亮蓝试剂盒 (南京建成,说明,595 nm波长测各样品吸光值,参照公式“蛋白浓度=测定 管吸光值/标准管吸光值X标准管浓度”检测各样品蛋白浓度,蛋白样品电泳分 离:取含蛋白40 |J g的样品,样品加1/5总体积的LB,最后用RIPA补齐至总 体积至25 M 1,混勻后95?C煮5 min)上样,在聚丙烯酰胺凝胶上,12%的分 离胶,约3/5总体积,4%的堆积胶,约2/5总体积,电泳分离蛋白样品，100 V, 4?C,2 h),蛋白样品电转移及预染,按顺序安装好转膜装置,黑色板-海绵- 三层滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-三层滤纸-海绵-红色板,。并完全排除气泡, 4?C, 100 V转膜2 h;将硝酸纤维素膜放入丽春红染液中染色约2?5 min,去 离子水漂洗至现出条带,用铅笔标出蛋白Marker位置,再用去离子水振荡以去 除染色,抗原抗体反应及显色,将膜转移至一培养皿中,37?C,用5%脱脂奶粉 封闭1 h (或4?C过夜,一将膜转移至塑料夹膜中,并加入1 : 200稀释的兔抗 大鼠CRH —抗一37?C摇床孵育约2 h—0. 1 moL/L的PBST洗涤4次,每次5 min—将膜转移至塑料夹膜中,并加入1 : 400稀释的山羊抗兔辣根过氧化酶标 记的二抗,37?C摇床孵育约30 min—0. 1 mol/L的PBST洗涤4次,每次5 min—将膜转移至塑料夹膜中,并加入DAB显色剂,显色时间视染色程度定，— 去离子水洗膜,扫描及分析。 2.5 放免法检测血清皮质酮 2.6 数据、图像处理及结果分析 Western Blot图片采用可见分析装置进行图像处理、拍照,Smartview分 析软件对条带进行密度扫描,得出条带密度值。结果以扫描密度值表示,放免 结果由分析软件将所测放射性比活度根据浓度曲线转化为浓度。所得数据均采 用?s表示,SPSS10. 0统计软件进行单因素方差分析,one-way AN0VA)。 3结果 3.1各组大鼠杏仁核CRH多肽表达 由表1可知,与青年对照组比较,老年对照组大鼠杏仁核CRH多肽表达显 著增高,与老年对照组相比,左归丸组及右归丸组大鼠杏仁核CRH多肽表达显 著下降。表1大鼠杏仁核CRH多肽表达,略, 3.2左归丸和右归丸对老年大鼠血清皮质酮,C0RT)含量的影响由表2 可知,与青年对照组比较,老年对照组大鼠血清C0RT含量显著增高,P〈0.05); 与老年对照组比较,左归丸组和右归丸组大鼠血清C0RT含量显著下降 (P<0. 05)。表2大鼠血清C0RT含量,略, 4讨论 下丘脑CRH是启动HPA轴调控的重要因素。但下丘脑以外CRH的调节作用 却知之甚少。1996年,Gray提出杏仁核含有高浓度的CRH结合蛋白、CRH受体 和皮质类固醇受体,提示杏仁核与CRH关系密切。最近研究报道,杏仁核含 CRH并参与对HPA轴的调节,衰老可引起杏仁核及下丘脑CRH的增高[2]。实 验发现,C0RT可刺激杏仁中央核表达CRH mRNA [3],CRH可增强杏仁中央核 GABA能突触传递,这种效应是由CRH1受体介导的[4]。因此,推测杏仁核不 是通过GABA能神经元抑制PVN,而是通过分泌CRH直接作用于下丘脑,兴奋性 调控HPA轴功能。 由于杏仁核不仅含有皮质类固醇受体,也含有丰富的CRH神经元。因此杏 仁核可以接受HPA轴的糖皮质激素信息反馈,促进CRH的合成和分泌,参与 HPA轴环路调节。本实验发现,与青年大鼠比较,老年大鼠杏仁核CRH多肽表 达和血清C0RT含量显著增高,推测杏仁核可以通过皮质类固醇受体接受HPA轴 终末激素GC的反馈信息,上调CRH多肽表达,发挥对HPA轴的兴奋性调控作用, 可能是杏仁核对HPA轴行使兴奋性调控的重要机制,左归丸、右归丸可下调杏 仁核CRH多肽表达,进而调节老年肾虚大鼠HPA轴功能紊乱。 【参考文献】 [1] Han JS, Bizon 几,Chun HJ, et al. Decreased glucocorticoid receptor mRNA and dysfunction of HPA axis in rats after removal of the cholinergic innervation to hippocampus [J] . Eur Neurosci, [2] Herman JP, Tasker JG, Ziegler DR, et al. Local circuit regulation of paraventricular nucleus stress integration: glutamate- GABA connections [J] . Pharmacol Biochem Behav, 2002,71 (3):457. [3] 祖衡兵.细胞因子与Alzheimer病[J].国外医学•神经病学神经 外科学分册,1998,25 (3): 154. [4] Turnbull AV,Prehar S,Kennedy AR,et al. Interleukin-6 is an afferent signal to the hypothalamo-pituitary-adrenal axis during local inflammation in mice [J] . Endocrinology, 2003, 144(5):1894.