美国柏尔莱克多巴胺M1008-03B
(中文翻译)
美国柏尔生物科技有限公司 (BIOO Scientific Corp.)
产品说明
莱克多巴胺酶联免疫反应测试盒使用说明书(M1008-03B)
一( 简介
1(试剂盒描述
TMMaxSignal莱克多巴胺酶联免疫反应测试盒适用于肌肉、动物组织、牛奶、饲料、尿液、血清、血浆中莱克多巴胺残留的定量检测,性能稳定、操作简单、灵敏度高。莱克多巴胺在中国和欧盟作为家畜的生产增长剂是非法的,为防止莱克多巴胺进入食物链,养殖者和政府监督管理部门需要准确、快速和灵敏的的检测技术。本试剂盒对反应中不同样品的检测限是0.02 ppb。该试剂盒有以下特点: ? 快速。10-60分钟之内可完成从肌肉,组织,饲料,尿液,牛奶中提取莱克多巴胺的全过程且回收率达到75-95%。
? 快速的ELISA检测
(在不考虑样品数量下只需不到2小时)。
? 高重复性。
2(试剂盒原理
TMMaxSignal克伦特罗酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联免疫反应原理,含有莱克多巴胺的抗原已经包被于微孔板上。测试分析时,样品和特异性HRP标记结合物共同添加到板上孵育。如果样品中含有莱克多巴胺抗原,就会竞争抗体,从而阻止抗体与板上抗原结合。加入TMB底物后将催化底物显色,根据颜色反应的灵敏度来确定样品中莱克多巴胺的浓度。颜色的深浅同样品中药物的浓度成反比关系。
3(试剂盒组成部分、储存及检测下限
(1)试剂盒包括:
内容物 规格 保存条件
已包被抗原的酶标板 1×96孔板(12×8孔) 2-8?
莱克多巴胺
液:
阴性控制(白) 0.8 mL
0.04 ng/mL (黄) 0.8 mL
0.1 ng/mL (橙) 0.8 mL 2-8? 0.25 ng/mL (粉红) 0.8 mL
0.6 ng/mL (紫) 0.8 mL
1.5 ng/mL (蓝) 0.8 mL
100 ng/mL(示踪物,可选,红) 0.8 mL
莱克多巴胺一抗 12 mL 2-8?*
100×HRP酶标二抗 250 µL 2-8?*
二抗稀释液 20 mL 2-8?
200×样品提取液(A) 25 mL 2-8?
10×样品提取液(B) 25 mL 2-8?
20×浓缩工作洗液 28 mL 2-8?
终止液 20 mL 2-8?
TMB底物 12 mL 2-8?
样品平衡液 0.5 mL 2-8? (2)试剂盒的保存
1
本试剂盒应当在2-8?的温度下储存,有效期为一年。如果三个月内不使用试剂盒,一抗和100×HRP酶标
二抗应置于-20?或者冷冻保藏。
(3)样品检测下限
检测物质 检测下限(ng/g)
0.64(快速提取法?)
饲料 0.8(快速提取法?)
0.02(有机溶剂提取法?)
肌肉/肝脏/肾脏 0.05(有机溶剂提取法?)
0.12(快速提取法)
牛奶 0.4
尿液 0.4
(4)交叉反应数据
药物 灵敏度 (ng/g或ppb) 交叉反应 %
莱克多巴胺(Ractopamine) 0.04 100
莱克多巴胺葡糖苷酸A(Ractopamine Glucuronide A) 0.1 45
莱克多巴胺葡糖苷酸B(Ractopamine Glucuronide B) 0.15 41
莱克多巴胺葡糖苷酸C(Ractopamine Glucuronide C) 0.05 97
克伦特罗(Clenbuterol) >10,000 <0.01
叔丁肾上腺素(Colterol) >10,000 <0.01
马布特罗(Mabuterol) >10,000 <0.01
利托君(Ritodrine) 50 1.0
苯氧丙酚胺(Isoxsuprine) 500 <0.01
沙美特罗(Salmeterol) 500 <0.01
酚间羟异丙肾上腺素(Fenoterol) >10,000 <0.01
比托特罗(Bitolterol) >10,000 <0.01
脲喘宁(Carbuterol) >10,000 <0.01
吡布特罗(Pirbuterol) >10,000 <0.01
特布他林(Terbuterol) >10,000 <0.01
噻吗洛尔(Timolol) >10,000 <0.01
间羟异丙肾上腺素(Metaproterenol) >10,000 <0.01
异丙(去甲)肾上腺素(Isoproterenol) >10,000 <0.01
沙丁胺醇(Albuterol) >10,000 <0.01
4(其他需要而本试剂盒未提的设备或材料
, 酶标仪(450nm)
, 恒温培养箱
, 匀质器
, 旋转蒸发仪或者氮吹仪、
, 漩涡振荡器
, 移液枪 (10、20、100和1000 µL各一支)
, 多道移液枪(50-300µL)
, 甲醇
, 乙腈
, 乙酸乙酯
2
, 正己烷
二.警告
实验前请阅读以下文字,以保证获得最佳实验效果。
? 标准品中含有克伦特罗,请小心使用。
? 不要使用过期的试剂盒。
? 不同批次的试剂盒不要混用,抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
? 尽量保持室温20-25?,避免在通风口操作防止温度过低,过热和/或者蒸发。同样的,不要在阳光直
射下实验,防止过热及蒸发。在孵育期间,如果工作台温度过低,应该铺垫若干纸巾或者其他物料。 ? 水质量很重要,确保使用蒸馏或者去离子水。
? 加入样品或者试剂到空的微孔板时,吸嘴靠于微孔接近底部,并保持接触。 ? 孵育时间的计算越
越好,保持添加标准品的一致性,先添加标准品后添加样品。 ? 从低浓度到高浓度地添加标准品,降低影响标准品曲线质量的风险。
? 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中,冷藏保存。
TM三. MaxSignal Ractopamine ELISA Test Kit检测方法
1(试剂的准备
所有的试剂在使用之前应将其回温至室温,并在使用试剂前摇动几下,以保证合理的浓度。 (1)二抗工作液
按1:99的比例来配制二抗浓缩液和二抗稀释液,配成二抗的工作液。
(2)1×样品提取液A
按1:199的比例配制样品200×提取浓缩液和双蒸馏水。
(3)1×样品提取液B
按1: 9的比例配制样品10×提取浓缩液和双蒸馏水。
(4)1×工作洗液
按1:19的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。
(5)甲醇:1×样品提取液;(4:1;V/V) (饲料快速提取法)
按1:4的比例配制1×样品提取液B和甲醇。举例:取2ml的1×样品提取液B加入到8ml甲醇中,配制成10ml的甲醇:1×样品提取液B;(4:1;V/V),按需要,可同比例放大或缩小。
2(样品的准备
2.1 饲料
2.1.1快速提取法?(该方法不适合于复合饲料)
(1)取1份饲料样品,加入2份溶液 [甲醇:1×样品提取液B;4:1;V/V](如1g 样品+2 mL溶液),使用适当匀浆器匀浆样品;
(2)称取1.5 g匀浆样品,室温(20-25?) 离心力4000g离心5分钟;
(3)移取0.1mL上清液到另一试管,加入0.7 mL 1×样品提取液B,充分混匀; (4)取50μL样品进行检测。
稀释倍数:16.0
2.1.2快速提取法?(该法均可用于普通饲料和复合饲料)
(1)样品使用适当的匀浆器进行匀质;
*(2)称取2克匀质的样品,并加入20mL 0.1M 盐酸。最大转速漩涡振荡15分钟; *(3)室温(22.5?2.5)?下离心力2000g离心10分钟,移取1 mL上清液到另一新试管,加入20μL 5M 氢氧化钠,调节pH为6-8;
*(4)室温(22.5?2.5)?下离心力2000g离心10分钟,移取0.5mL 上清液到另一新试管,加入0.5mL
1×样品提取液B,充分混匀;
3
*(5)取50μL样品用于检测。
稀释倍数:20
2.2 肌肉/肝脏/肾脏
2.2.1快速提取法(鲜肉检测)
(1)除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪,使用适当的匀浆器进行匀浆;
(2)称取0.5克匀质的样品,并加入1mL 1×样品提取液A。最大转速漩涡振荡3分钟或摇床20分钟; (3)室温离心力4000g离心5分钟,移取0.5mL上清液到另一试管(避免接触脂肪层); (4)75?孵育5分钟,最大速度漩涡振荡1分钟;
(5)室温离心力4000g离心5分钟;
(6)移取0.2mL上清液到另一试管,加入5μL样品平衡液,充分混匀;
(7)取50μL样品进行检测。
稀释倍数:3.0(为避免高背景值,已知阴性样品应作平衡,从测试结果中抽掉阴性样品结果)
2.2.2 有机溶剂提取法?(咸肉、腌肉、鲜肉检测)
(1)除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪,使用适当的匀浆器进行匀质;
(2)称取3克匀质样品,并加入8mL乙腈和1mL乙酸乙酯。最大转速漩涡振荡3分钟; (3)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心5分钟,移取6 mL上清液到另一新试管; (4)在60-70 ?减压蒸馏或60-70?水浴氮气吹干;
(5)加入1mL正己烷溶解样品,并加入1mL 1×样品提取液B,最大转速涡旋振荡1分钟; (6)打开管盖,将样品置于85?水浴3分钟(如果下层液量足够用以检测,此步骤可以忽略); (7)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心5分钟,取50μL下层液用于检测。
稀释倍数:0.5
2.2.3 有机溶剂提取法?(适合高脂肪产品)
(1)除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪,使用适当的匀浆器进行匀质;
(2)称取2.5g 匀质样品,并加入10mL 甲醇,最大转速漩涡振荡10分钟或在多管道漩涡器(振荡器)摇荡10分钟;
(3)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心10分钟,移取4 mL上清液到另一新试管; (4)在50-60?减压蒸馏或50-60?水浴氮气吹干;
(5)加入4mL正己烷溶解样品,振荡2分钟,再加入1mL 1×样品提取液B,最大转速涡旋振荡2分钟; (6)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心10分钟;(如果已生成乳状液,先将样品置于80-95?水浴3分钟,然后以室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心10分钟);
(7)取50μL下层液用于检测。
稀释倍数:1.25
2.3 牛奶
(1)无脂牛奶用1×样品提取液B稀释10倍(如20µL牛奶+ 180µL提取液),直接取50μL用于检测。 (2)含脂牛奶在使用前需要以4000g离心5分钟,除去上面脂肪层。取清液用1×样品提取液B稀释10倍(如20µL牛奶+180µL提取液),直接取50μL用于检测。
稀释倍数:10.0
2.4 尿样
(1)取0.5mL尿室温下离心力4000g离心5分钟;
(2)取50μL上清液用于检测。
稀释倍数:10.0(为避免高背景值,建议使用1×样品提取液B对尿样进行10倍稀释(1:9),调节pH在中性范围)
3(酶联免疫反应测试步骤
4
以下为计算份量的
格,用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。
试剂 每个反应需要的体积 24次反应的体积
一抗 100μL 2.4 mL
HRP酶标二抗 150μL 3.6 mL
工作洗液 2 mL 48 mL
终止液 100μL 2.4 mL (1)加入50µL的标准液或样品于所设定的孔中,样品需作平衡检测; (2)在每孔中加入100µL一抗,轻敲微孔板边缘混匀1分钟;
(3)室温下避光孵育30分钟;
(4)洗板3次,每次加入250µL 1×工作洗液,最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干; (5)在每孔中加入150µl 1×HRP酶标二抗,轻敲微孔板边缘混匀1分钟,室温下避光孵育30分钟; (6)洗板3次,每次加入250µL,最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干; (7)加入100µl的TMB底物(底物本身是透明的,出现颜色改变不能使用。孵育时适当覆盖微孔板),轻敲微孔板边缘混匀1分钟;
(8)室温下避光孵育15分钟后,加入100µl的终止液终止反应,尽快在450nm下读OD值(读书前使用无绒布擦拭底部水分和指模)。
4(结果计算
(1) 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ×100
(2) 以相对吸光度值为纵坐标,标准浓度为横坐标建立标准曲线。
(3) 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
(4) 样品检测下限和定量下限计算方法如下:
样品检测下限 = (0.04ng/g) ×(稀释倍数)
样品定量下限 = (0.1ng/g) ×(稀释倍数)
备注:如结果呈阳性反应,应该用其他检验方法(如色谱/质谱方法等)进行确证。
以下曲线图是莱克多巴胺酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线
Ractopamine Standard Curve
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10Relative Absorbance(%)0
0.1110100
Standard ng/mL(log10)
四. 问题与解决
1.标准品无颜色变化或者无相应数值
可能原因 解决方法
5
试剂使用顺序混乱,或者操作步骤出错。 遵循实验说明重复实验。
使用了错误的抗体,或者二抗配制错误、失效。 确保抗体来自同一试剂盒,所有抗体不同批次之间
有一定的差异,确保二抗的配制无误。 TMB底物失效。 使用新的BIOO TMB底物。
2.低吸光度(OD值)
可能原因 解决方法 试剂过期,或者不同的批次混用。 查证过期试剂和批次。
洗液配制错误。 使用试剂盒提供的洗液,正确配制。 过多次洗涤。 按照说明书要求进行洗涤。
孵育时间过短。 按照说明书要求,严格计算好时间。 实验室温度过低。 保持实验室温度在20-25?,不要在空调风口或者
寒冷的窗户旁进行实验。
试剂或者微孔板温度过低。 确保试剂或者微孔板完全回温,在实验开始前,将
试剂放置盒子外最少1小时。 使用错误波长读数,或者酶标仪失灵。 确保450nm波长读数,检查酶标仪。 试剂盒处于极端的条件。 检查试剂盒从冰箱拿出使用的次数,检查试剂盒是
否放置极端温度(过冷或者过热)时间太长。 3.过高的背景值或吸光度(OD值)
可能原因 解决方法 使用了质量差的水。 如果使用的水可疑,尝试使用蒸馏水配制洗液。 底物失效。 确保加入微孔板前,底物是无色的。 洗涤不当或者洗板机洗板效果不好。 采用说明书建议的洗涤次数,每次每孔至少加入
250μL洗液。检查洗涤系统,排除故障。 酶标仪失灵。如果OD值读数很高而颜色很浅,那个使用校正微孔板检查酶标仪,检查光源。 这是非常可能的情况。
实验室温度过高。 保持实验室温度20-25?,避免在热源或者阳光直
射处实验。
试剂混淆,被污染或者配制不当。 确保使用正确的试剂,准确配制,避免污染。 4.板内差异性大
可能原因 解决方法 加入标准品,试剂和样品的时间不一致。 确保所有试剂可用,尽可能使用多道枪加样,加标
准品,试剂和样品途中,不能中断。 多道枪使用不当。 校准多道枪,检查吸嘴是否套紧,确保吸液量一致。 洗涤系统出现故障。 检查洗涤系统,保持良好运行。 5.板间差异性大
可能原因 解决方法 板与板之间孵育时间相差太大。 独立计时,确保一致的孵育时间。 板与板之间不一致的洗涤过程。 确保相同的洗涤次数,保证洗涤系统正常运作。 使用移液枪不当。 检查移液枪,确保吸取相同液量。 微孔板,试剂,标准品和样品处于不同温度。 确保微孔板,试剂,标准品和样品充分回到室温,
如果试剂体积较大则需要回温较长时间。不能用温
水浴回温样品。
不同批次的试剂混用,或者试剂盒过期。 注意试剂不要混用,不同的试剂盒可能显示不同的
6
OD值,但是相对吸光值是有很好的对比性的。通常
0标准品的OD值小于0.6显示试剂质量下降。 6.一个或者多个标准品数据点超出曲线范围
可能原因 解决方法 标准品添加顺序混乱,或者放置于错误位置。 按照说明要求重复实验,保证标准品添加正确。 标准品被污染或者与其他标准品混淆了。 改用新的标准品,按照由低浓度到高浓度的顺序添
加标准品。
洗涤不一致或者洗涤系统失灵。 遵循一如既往的洗涤方式,检查洗涤系统。 加入标准品和试剂的时间不一致。 确保一切就绪,由低浓度到高浓度添加标准品并保
证不被打扰,使用多道枪移液。 多道枪使用不当。 校准多道枪,检查吸嘴是否套紧,确保吸液量一致。
附:中英文对照
Negative control 阴性质控(0标准品)
Ractopmine Antibody #1 莱克多巴胺一抗
HRP-Conjugated Antibody #2 HRP-酶标二抗
Antibody #2 Diluent 二抗稀释液
Sample Extraction Buffer 样品提取液
Wash Solution 工作洗液
Stop Buffer 终止液
TMB Substrate TMB底物
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