链霉素对葫芦藓叶肉细胞叶绿体抑制作用的研究

链霉素对葫芦藓叶肉细胞叶绿体抑制作用的研究 邓凯 胡歆 胡成虎 【摘要】 本实验用叶绿体光合产物染色的方法，研究链霉素对葫芦藓叶肉细胞叶绿体的抑制作用。我们对正常培养和遮光培养的葫芦藓植株进行一定浓度的链霉素处理，通过细胞内可见叶绿体的数量变化，初步揭示了链霉素对植物细胞叶绿体抑制作用的效果和机制，并推测在链霉素作用下，叶绿体蛋白的工作寿命。 【关键词】 链霉素; 葫芦藓; 叶绿体; 抑制 引言 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，其功能是进行光合作用，即利用光能同化二氧化碳和水，合成糖类物质，同时产生分子氧。叶绿体在植物细胞中扮演着独一无二的角色，与植物的生命代谢活动密切相关。构成叶绿体的蛋白质，大约有90,是由核基因编码的，剩余的10,由叶绿体基因编码[1]。叶绿体基因编码的蛋白在叶绿体基质中的核糖体合成，是光合电子传递链的组成成分。如果电子传递链某一个环节上的蛋白质失活，就将干扰光合作用的正常进行。因此，若有一种物质能抑制叶绿体内蛋白质的合成，就有可能进而影响到叶绿体的功能[2]。 链霉素是一种常用的抗生素，它的作用机制是抑制起始tRNA和非起始tRNA与核糖体的结合，导致肽链合成的提前终止，从而抑制蛋白质的合成[3]。因此，链霉素在临床上被广泛应用为抑菌药物。内共生起源假说认为，真核细胞的叶绿体由蓝藻或光合细菌内共生进化而 来[4]，因而，链霉素可能对叶绿体有抑制作用。一直以来，对链霉素的研究多数集中在临床应用或微生物抗生素标记筛选方面，甚少涉及植物领域，其对叶绿体作用的研究更是鲜见。 叶绿体光合作用的产物主要是葡萄糖，其中一部分产物合成后转化为淀粉颗粒并暂时贮存在叶绿体的淀粉核中。故此，正常的叶绿体可以被碘,碘化钾溶液染成蓝紫色，并在显微镜下呈现淀粉粒的颗粒状。受到抑制作用的叶绿体，显微镜下可见的被染色淀粉粒的数量会减少。研究表明，链霉素可以透过真核细胞的膜系统，作用于叶绿体内核糖体，且微量链霉素对于染色液本身的影响很小。 我们用叶绿体活体染色的方法，观察一定浓度的链霉素在不同时程条件下对葫芦藓叶肉细胞叶绿体的抑制作用，尝试探讨链霉素对植物叶绿体内蛋白合成的抑制作用，并进一步叶绿体蛋白工作的寿命。 1 材料和试剂 1.1 实验材料:葫芦藓(Funaria hygrometrica Hedw) (采集于广州市芳村区污水处理厂附近) 1.2 实验试剂: , 植物培养液，配方见表1[5]。 表1.植物培养液配方 KNO3 Ca(NO3)2 MgSO4?7H2O KH2PO4 试剂 0.51 0.82 0.49 0.136 浓度/g?L-1 (2)Lugol’s溶液(I2-KI染液):取6克碘化钾溶于20毫升蒸馏水中，搅拌到溶解后，加入4克碘，待碘充分溶解后，加入80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内[6]。 (3)链霉素溶液:称取硫酸链霉素粉末0.4g，加入10ml植物培养液配成40mg/ml的链霉素溶液于冰箱内储存。实验时可取储存液50μl,加入植物培养液至2ml，即配成1000μg/ml的链霉素溶液。 2.研究方法 将采集的葫芦藓分成两份(样品A和样品B)，分别置于适当容器中培养。样品B用黑塑料带封口(在封口上开若干小孔，方便材料呼吸,并在容器底部开小口，将容器下部置于盛有适量清水的塑料盆中，以保持材料湿润)，置于暗室中培养，5天后观察时取用[7]。样品A(保持湿润)置于室外在适当光照下培养。 2.1链霉素对未遮光材料的处理 从样品A中取葫芦藓植株若干，分别置于盛有空白培养液、1000μg/ml链霉素培养液的培养瓶中培养。实验时，从培养的样品中取葫芦藓植株，在解剖镜下剥取叶片。在载玻片上滴一滴I2-KI染液，将取下的葫芦藓小叶置于染液中染色，盖片，半分钟后，用培养液洗去染液，置于高倍镜(10×40)下观察。 用上述方法分别观察在空白培养液及链霉素溶液中培养1天、2天、3天的葫芦藓叶肉细胞。 2.2链霉素对遮光材料的处理 从样品B中取葫芦藓植株若干，分别置于盛有空白培养液、1000μg/ml链霉素培养液的培养瓶中培养。用2.1所述制片方法分别观察在空白培养液及链霉素溶液(置于光照下)中培养30分钟、1天、2天、3天的葫芦藓叶肉细胞。 3 结果与分析 3.1鉴别处于不同生活及染色状态的细胞 在实验中，发现经过不同处理的细胞会呈现不同的特征，根据这些特征，可以反过来鉴 别细胞所处状态。 , 新鲜的没有染色的细胞:细胞质无色透明，可见细胞膜及细胞壁。由于含叶绿素， 叶绿体呈现浅绿色，以颗粒状分布于细胞质中。(图1a) , 正常的染色细胞:胞质无色，其中可见叶绿体被染成黄褐色。由于染色时间较短， 且在染色后进行了培养液漂洗，使得染上的颜色稍浅，并不呈现典型的蓝紫色。(图 1b) , 受链霉素抑制的染色细胞:可见细胞中被染色叶绿体的数量显著减少，无色透明的 细胞质可见区域增大。(图1c) , 经过遮光处理(5天)后的染色细胞:整个细胞质部分无色透明，细胞壁被染成轻 微的黄褐色，可能是由于细胞饥饿时胞壁中部分纤维素转化为淀粉而导致。(图1d) 因此，在实验中，我们选取被染上色的细胞进行观察，通过比较视野中细胞叶绿体的数目来反映叶绿体受到链霉素抑制的程度高低。需要说明的是，由于染色与漂洗的操作因素所致， 在显微镜下看到的叶绿体染色的深浅程度有所不同，但这并不影响我们的实验效果，可见叶绿体的数量是我们判断叶绿体是否被抑制的最主要的依据。 图1a 图1b 图1c 图1d 图1不同生活及染色状态的细胞 图1a:新鲜的没有染色的细胞;图1b:正常的染色细胞; 图1c:受链霉素抑制的染色细胞;图1d:经过遮光处理(5天)后的染色细胞 3.2链霉素对未遮光材料叶绿体的抑制 据资料显示，链霉素对蛋白小球藻抑制实验的报道浓度[8]为最低600μg /mL，本实验所用的链霉素浓度为自定的1000μg/mL。 图2显示了我们在不同时程条件下，用含链霉素的培养液处理葫芦藓后镜检的结果。纯培养液中培养相同时间的葫芦藓制片作为空白对照(每组左侧为空白对照)。 我们发现链霉素短时间(30分钟)抑制后，细胞内叶绿体的数目并没有明显减少(图2a’)，与空白对照组(图2a)差别不大。这说明链霉素对叶绿体没有即时的抑制作用。我们分析这可能与链霉素不会直接作用于正在工作的叶绿体蛋白有关。为了观察叶绿体蛋白在链霉素存在条件下的工作状况，我们继续对葫芦藓作了更长时间的链霉素培养处理。 在用链霉素分别处理了1、2、3天后，我们取出相应的材料制片观察，发现链霉素对叶绿体的抑制效果明显，并且呈现较显著的时间,效应比例关系:在链霉素培养液中培养1天的细胞(图2b’)中，叶绿体数量有所减少，且排列较空白组稀疏;培养2天的细胞(图2c’)中，叶绿体数目更少，可以看见大片透明的细胞质区域;培养3天的细胞(图2d’)中，可以看到只剩下极少数的叶绿体，分布在靠近胞膜的部位。另一方面，在空白培养液中培养了1、2、3天后的细胞中(图2b、c、d)，叶绿体排列致密，数量没有明显变化。 图2a 图2a’ 图2b 图2b’ 图2c 图2c’ 图2d 图2d’ 图2受链霉素抑制的正常细胞 图2a组:链霉素处理30分钟(左侧为空白对照结果，下同); 图2b组:链霉素处理1天;图2c组:链霉素处理2天; 图2d组:链霉素处理3天 上述的实验结果基本上与我们实验前的设想相吻合。可以看到1000μg /mL的链霉素在较长的时程条件下，对葫芦藓叶肉细胞叶绿体蛋白质的合成有一定的抑制作用，导致叶绿体光合作用产物的生成量显著减少。并且我们还发现，随着链霉素作用时间的增长，叶绿体受抑制的效果越来越明显，具体表现为叶绿体数量依次减少。我们可以推测，叶绿体蛋白合成遭抑制后，原有蛋白失活后无法更新，结果导致光合反应过程的中断，植物无法将获取的光能转化为化学能储存在光合产物中，因而碘,碘化钾染液无法使失活的叶绿体染上颜色。根据实验结果，我们估计，叶绿体蛋白工作的寿命大致为3天。 为了进一步确定叶绿体在链霉素作用下，叶绿体蛋白活性的变化情况，我们继续进行了下面的实验。 3.3链霉素对遮光材料叶绿体的抑制 经遮光处理5天后，葫芦藓叶肉细胞(图3a)中叶绿体已不可见，说明光合作用所合成的产物已经被消耗殆尽。在黑暗中，由于叶绿体不能进行光反应，因此也没有新的光合作用产物合成。 处理1天后，空白培养液中的细胞(图3b)内出现了大量叶绿体，链霉素培养液中的细胞(图3b’)内也可见较多数量的叶绿体。这说明叶绿体的功能没有因为经遮光处理而受到影响:当重新给予叶片光照后，叶绿体能够继续行使正常的生理功能，合成光合作用产物。经链霉素处理的叶绿体基本上没有受到抑制，表明叶片中原有的叶绿体仍然保持很高的活性。 处理2、3天后，空白培养液中的细胞内(图3c、3d)叶绿体的数量继续增多;而在经链霉素处理的细胞中，叶绿体的数量明显下降:处理2天后的细胞(图3c’)中央出现了透明的空洞，叶绿体集中分布在靠近胞膜的部位，数量有所减少;处理3天后的细胞(图3d’)中，叶绿体寥寥无几，只有极少数叶绿体仍然能被染色。此结果说明，当叶绿体被链霉素处理较长时间后，蛋白质逐渐失活，由于链霉素对叶绿体核糖体的抑制作用，细胞不能合成新的蛋白质进行替换，导致光合作用产物在消耗后无法继续合成，使得叶绿体不能被染料染色。 该研究发现，受链霉素抑制的叶肉细胞中的叶绿体数量先逐步增加，后又逐步减少，显示在链霉素作用的初期，叶绿体蛋白处于其工作寿命期限之内，仍具有很高的生物活性，但是随着作用时间的延长，叶绿体蛋白逐渐失活，导致光合反应过程受到阻碍，影响光合产物的合成。 图3a 图3b 图3b’ 图3c 图3c’ 图3d 图3d’ 图3受链霉素抑制的遮光后细胞 图3a:经过遮光处理后的染色细胞(未经链霉素处理); 图3b组:链霉素处理1天(左侧为空白对照结果，下同); 图3c组:链霉素处理2天;图3d组:链霉素处理3天 4 结论与展望 我们用固定浓度的链霉素在不同的时程条件下对正常培养的及经过遮光培养的葫芦藓植株进行了处理，借助光合产物染色的方法观察叶绿体的数量变化，研究结果显示，链霉素对葫芦藓叶肉细胞叶绿体是有抑制作用的。 链霉素对正常培养的葫芦藓叶绿体短时间的处理并没有达到抑制的效果;对遮光培养的叶绿体处理1天后，也没有表现出显著的抑制作用，相反，叶肉细胞中可见叶绿体的数量却比遮光后期明显增多。根据两方面的实验结果我们可以推测，链霉素并不直接作用于叶绿体内 的蛋白质，没有即时的抑制效果，蛋白质在其工作寿命的期限内仍然可以继续发挥其生物活性，帮助叶绿体行使正常的生理功能。 在经过较长时间的链霉素处理后，无论在正常的葫芦藓还是经过遮光培养的葫芦藓叶肉细胞中，都可以看到叶绿体数量随着时间的延长而逐步减少的现象。这说明当原有蛋白质超出其工作寿命而失活后，由于链霉素抑制了新的蛋白质的合成，导致光合作用的进行受到影响，叶绿体无法合成新的产物，造成无法被染上色，因而，可见的叶绿体数量减少。 图4 推测的遮光后链霉素处理的葫芦藓叶绿体蛋白活性变化 对遮光材料的处理结果显示，在受到链霉素作用后的第1天与第2天间，叶绿体蛋白的工作状态出现了显著的变化，据此我们可以估计，在链霉素作用的第1天内，蛋白质的活性基本保持不变。在作用的第2天期间，蛋白质的活性可能有一个急剧降低的阶段，随后其活性继续降低，直至完全失活。我们根据实验结果推测了链霉素作用下的叶绿体蛋白工作活性变化的趋势。(图4)两方面的实验结果都显示，链霉素处理3天后细胞内可见的叶绿体几乎均已消失，因此我们可以推测叶绿体蛋白存活或工作的寿命大致为3天。 叶绿体基因组虽然只编码叶绿体蛋白质总量的10,，但是涉及到一些在光合反应过程中起重要作用的蛋白质。如叶绿体基质中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)是植物进行CO2固定的重要酶类。它总共含有16个亚基，其中8个大亚基由叶绿体基因编码， 在叶绿体内的核糖体合成[9]。我们可以估计，链霉素对叶绿体的抑制作用直接阻碍了Rubisco大亚基的合成，当原有大亚基蛋白失活后，Rubisco全酶的活性也将失去，进而影响碳同化的进行，最终影响光合产物的积累。此例子从一个侧面阐释了链霉素对叶绿体抑制作用的机理，也更进一步说明了链霉素叶绿体的作用效果是显著的。 链霉素对葫芦藓叶肉细胞叶绿体的抑制作用说明，虽然不同类型的生物在机体结构和功能上有着较大的区别，但是长期以来多用于作为临床抗菌药物的链霉素对植物体也具有一定的作用效果。这可能对我们寻找新的植物生长调节物质有所启发。 叶绿体和光合作用是植物生理学研究的核心内容之一，我们通过以上研究初步探讨了叶绿体受链霉素抑制的一些机制，但是很多更深入的问题仍然未能解决。我们还可以通过一些其它的实验，进一步确定叶绿体蛋白工作的确切寿命，或者研究链霉素在叶绿体复制过程中的作用，以及其他抗生素在叶绿体代谢过程中所扮演的角色，最终通过比较分析植物叶绿体及古光合细菌在蛋白翻译合成过程中的异同，来研究两者在进化层次上的亲缘关系。 参考文献: , 王金发. 细胞生物学，科学出版社，2003年第1版:311 , 严日辉，李立人. 几种因子对离体豌豆叶绿体蛋白质合成的影响，植物生理学报， 1998，24(1):77-82 , 吴雪琼. 结核分支杆菌耐链霉素分子机制的研究进展，微生物学免疫学研究进展， 1998，26(3):81-83 , 王广策，张娟. 叶绿体基因组结构与表达调控，生物学通报，1997，32(8):5-7 , 上海植物生理学会. 植物生理学实验手册，上海科学技术出版社，1985年第1版 : 61 , 沈芸荪. 上海药物实用手册, 文汇出版社，1992:12 , 陈平平，孙美姝. 用葫芦藓证实叶绿体是光合作用的重要细胞器，生物学通报，1999， 34(6):38-39 , 陈颖，李文彬，张利明，孙勇如. 小球藻对5种常用基因工程抗生素的敏感性研究， 海洋与湖沼，1999, 30(5):500-505 , 陈润政，黄上志，宋松泉，傅家瑞. 植物生理学，中山大学出版社，1998年第1版: 53 The Inhibition of Streptomycin to the Chloroplasts in Funaria hygrometria Mesophyll Cells DENG Kai, HU Xin, HU Cheng-hu (Biochemistry 2001, School of Life Sciences, SunYat-senUniversity, Guangzhou, 510275) 【Abstract】 This experiment studies the inhibition of streptomycin to the chloroplasts in Funaria hygrometria mesophyll cells, using a method by dyeing the photosynthesis products. Objects which have been cultured normally or in lightless condition are both treated with streptomycin. By observing the changes of the chloroplasts’ number, we show the effects and mechanism of the inhibition of streptomycin to chloroplasts in plant cells, and speculate the working time of proteins in chloroplasts which are inhibited by streptomycin. 【Key Words】 streptomycin; Funaria hygrometria; chloroplast; inhibition