瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响

瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响 瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响 【摘要】 目的 观察瘦素对人L 02脂肪变肝细胞三酰甘油(TG)沉 积的影响，探讨瘦素在非乙醇性脂肪性肝病发生、发展中的作用。方 法 人肝L 02细胞培养接种于50 ml 培养瓶中，用50%胎牛血清 1640培养基造模，时间24 h。设立正常组、模型组、瘦素处理1，2， 3组，处理组瘦素浓度分别为10-7 mol/L，10-6 mol/L，10-5mol/L， 分别处理6 h;再以10-6 mol/L 浓度瘦素建立时效关系分别处理(6， 及24 h)。每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况，高效液相色谱 测细胞内TG含量变化。结果 油红“O”染色显示50%的胎牛血清的 1640培养基24 h 能成功地制造肝细胞脂肪变性模型，加入瘦素处理 后脂肪化程度减轻。高效液相色谱显示细胞内TG明显减少，且与瘦 素呈剂量、时间依赖性关系。结论 肝细胞脂肪变性时，瘦素能使肝 细胞脂肪化程度减轻，能减少肝细胞TG的沉积,对脂肪肝防治有一定 的作用。 【关键词】 脂肪变肝细胞;瘦素;三酰甘油 Effects of Leptin on Disposition of Triglyceride in Fatty Liver Cells Zhou Hong yu,Yang Xue feng (Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital, Nanhua University, Hengyang 421001, China) Abstract: Objective To explore the effect of leptin on triglyceride‘s disposition in normal and nonalcoholic induced fatty liver cell. Methods L 02 liver cells were cultured in 50 ml culture dish. Fatty liver cell models were made with 50% inactivated embryo blood serum for 24 hours.Results Oil red staining showed that 50% inactivated embryo blood serum can make fatty liver cell model. After L 02 liver cells were turned into fatty liver cells, leptin was added to fatty liver cells. The HPLC showed that the model group‘s triglyceride disposition increased clearly, but after leptin was given into the model cells, triglyceride‘s disposition decreased obviously, which was positive correlated with leptin‘s concentration. Conclusion When liver L 02 cells were turned into fatty liver cell, leptin can inhibit triglyceride‘s disposition. Leptin has some therapeutic effect on fatty liver cells. Key words: fatty liver cell; leptin; triglyceride 非乙醇性脂肪肝(NAFLD)是一种肝组织学改变与乙醇性肝病相类似，但与饮酒无明确关系的临床病理综合征，根据其病理学改变及临床现分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化[1,2]。肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所，肝脏选择性地摄取血中的非饱和脂肪酸，经酯化合成三酰甘油(TG)，TG在肝细胞内，一方面氧化供能，另一方面分泌入血转化为低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)被其他组织利用。肝脏所含脂质绝大部分为TG，各种致病因素可导致肝细胞内TG异常堆积而导致脂肪肝(FLD)的发生。瘦素是肥胖基因(obese gene)编码的蛋白产物，其受体广泛分布于脂肪、骨骼肌、肝脏、心、肺、胰、卵巢、睾丸等外周组织。瘦素通过与受体结合而发挥作用。瘦素的主要作用是调节机体脂肪的稳定，抑制食欲、增加能耗和减少体质量。本研究以人肝L 02脂肪变细胞模型，通过油红“O”染色、高效液相色谱等对瘦素作用后的脂肪变细胞进行研究，了解瘦素与NAFLD的关系，并初步探讨了瘦素对其的治疗作用。 1 材料和方法 1 1 主要试剂和仪器 1640培养基(GIBCO)， 胎牛血清 (成都哈里生物有限公司)，胰蛋白酶 (Sigma)，1，2，4丁三醇(Buches 瑞士)，油红“O” (北京生物化学有限公司)，正己烷、异丙醇、乙腈(国产分析物)。二氧化碳恒温培养箱(日本SANYO公司)，超净工作台(德国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)，50 ml 培养瓶，24孔细胞培养板 (NUNC公司)，酶标分析仪(美国Bio Rad550)。 1 2 实验方法 1 2.1 非乙醇性脂肪变肝细胞模型的建立 人肝L 02细胞株培养接种于50 ml 培养瓶中，在含体积分数10%的灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 链霉素的1640完全培养基中，于37?，5%二氧化碳培养，饱和湿度，贴壁生长，待细胞长满80%瓶底，消化液消化传代。在更换新鲜培养液后加入胎牛血清，使其浓度为50%，继续培养24 h，即形成非乙醇性肝细胞脂肪变性模型。设正常组、模型组、瘦素处理1，2，3组，瘦素处理组的瘦 素浓度分别为10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L，分别处理6 h;再以10-6mol/L 浓度瘦素建立6，，24 h 的时效关系分别处理。每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况，高效液相色谱测细胞内TG含量变化。 1.2.2 油红“O”染色观察造模是否成功 采用Lillie氏油红“,”染色法:将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养板，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5 min，50%异丙醇固定1 min，油红“O”染色液染色10 min，蒸馏水冲洗3次，每次1 min，苏木素染色5 min，分色和返蓝后，HPIAS 1000 型图像分析系统收集图像。按Wada方法进行脂质染色的半定量分析即根据脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”，细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”，每一块玻片计数100个细胞。 1.2.3 色谱分析和计算 安捷伦HP1100单元泵，自动进样器，紫外监测器和化学工作站进行分析。检测波长230 nm，流速0.7 ml/min，采用梯度洗脱A:乙腈 B:水0~ min:75%A~95%A: 1 min~18 min:75%A。将溶液浓度对甘油/内标峰面积比值线性回归后得回归方程用于样品甘油浓度的计算。TG的浓度为总甘油浓度 游离甘油浓度。 1.3 统计学方法 统计分析用SPSS软件，实验数据用均数?标准差(?s)表示 ，两组数据资料比较用t检验及方差分析，P0(05为有显着性差异。 2 结果 2 1 人肝L 02细胞脂肪化 正常细胞用50%胎牛血清培养基培养24 h 后，用油红“O”染色，显微镜下观察，细胞浆内有大量脂滴存在，符合脂肪化肝细胞特点。同时用高效液相色谱分析细胞内TG明显增加，与正常肝细胞比较有显着性差异(P0(05)，其中细胞内TG从20.19 μg/g 增加到77.51 μg/g，说明细胞内有大量TG聚集，造模成功。 2.2 瘦素对人肝L 02脂肪变细胞TG的影响 人肝L 02细胞用50%的胎牛血清培养24 h 后，分别加入瘦素10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L 培养6 h。油红“O”染色，显微镜下观察，细胞内脂滴依次减少。瘦素10-5mol/L 时效关系显示油红“O”染色细胞数明显依次减少。高效液相色谱分析细胞内总甘油与TG模型组比较有显着性差异(P0(05)。与瘦素呈时间、剂量依赖性关系(见表1，2)。表1 瘦素对人肝L 02细胞细胞内TG影响的量效关系(略)表2 瘦素对 人肝L 02细胞细胞内TG影响的时效关系(略)