醋酸甲孕酮对雄性大鼠骨髓嗜多染红细胞和生精细胞微核的影响

醋酸甲孕酮对雄性大鼠骨髓嗜多染红细胞和生精细胞微核的影响 醋酸甲孕酮对雄性大鼠骨髓嗜多染红细胞 和生精细胞微核的影响 癌变?畸变?突变2004年3月第l6卷第2期Carcinogenesis.TeratogenesisandMutagenesisVol16No2Mar.2Oo4 文章编号:1004—616X(2004)02—0107—03?研究? 醋酸甲孕酮对雄性大鼠骨髓嗜多染红细胞和生精细胞微核的影响? 贾悦,崔毓桂!,王兴海,童建孙,马鼎志.,蔡瑞芬.,狄福松 (1.南京医科大学第一附属医院内分泌科,江苏南京210029;2南京医科大学第一附属医院中心实验室,江苏南京 210029;3.江苏省生育研究所,江苏南京210034) 【摘要】背景与目的:观察单独使用不同剂量的醋酸甲孕酮(Meddrox3-progesteroneacetate,MPA)对雄性大鼠骨髓和生精细胞微核 的影响:材料与方法:50只大鼠分组后给予每月一次MPA(37.5或75或150mg/kg)肌肉注射;另以等体积生理盐水为对照,共 3个月,每组中的一半动物在停药后即处死,另一半动物在停药9个月后处死测定各组大鼠给药后骨髓与生精细胞微核率和精 子计数及形态=结果:与对照组相比,各实验组大鼠生精功能均明显受到抑制:各实验组大鼠骨髓嗜多染红细胞的微核发生率 无明显升高=各实验组生精细胞做核率明显增加,同时附睾精子观察不仅精子数量下降,而且畸形率升高,其中大剂量MPA组 生精细胞微核率增加和精子畸形率升高最为明显;但停药9个月后各实验组生精细胞微核率下降至空白对照水平,同时附睾精 子数量增加,畸形率减低:结论:单独使用MPA对雄性大鼠体细胞无致突变效应;虽然可以引起生精细胞微核率明显增加,但停 药9个月后恢复: 【关键词】MPA;雄性大鼠;骨髓嗜多染红细胞;生精细胞;微核率 中图分类号:R339.21文献标识码:A TheMicronucleusTestofAcetateinBoneMarrowwPolychromaticErythrocytesand SpermatogenicCellsofMalerats JIAYue,CUIYu.gui!,WANGXing-hai.,etal f.Endocriolog)Department.theFirstAffiliatedHospitalofNangMedicalUniversit),Nang210029,Chian; 2.Ke)Lab,theFirstAffiliatedHospitalofNangMedicalUniversit),Nang210029,China;3.JiangsuFamil) PlanningInstitute.Nang210034.China.J [ABST~CTIBACKGROUND&AIM:TostudytheeffectofMeddroxyprogesteroneAcetateOllthemicronucleusratein honeman'o~pol>'(.hromaticer3. ,throev. tesandspermatogeniccellsofmalerats.MATERIALANDMETHODS:50ratswere classifiedinto4groups.Ea('hgrnupreceivedinjectionofsaline 【groupC)orMPA(37.5.75and150mg/kg)(group Pi,groupPa1]dglDupPj.1"espectix'ely)fol'everymonthduring3months.Datafi'omspermcounting,sperm lnodality,andthemicl'onu~.leusrateillbonemarrowpolychromatieerythrocytesandspermatogeniecellswerecollected andanalysed.RESULTS:SpemmtogenesisofratsundergoingadnfinistrationofMPAhadbeensuppressed.Testisofrats ingToupPi.PandPatrophiedalldspermcountingdecreasedremarkablycomparedwithgroupC.Therewasno statisticsdiffel'ell(e0fthelllit'ronuele~ISrateinbonemarrm~polyehromatieerythroeytesbetweeneachgroup.The lnierolmeleusrateillspemmtogeni(' 【'ellsingl~3upPandPmised.butresumedtonormal"afterMPAdepri~ed9 months.CONCLUSION:MPAhasnosignificantefl'ectonincreasingtheincidenceofthemicronueleusrateinbone marrowpo1)('hromati('elythroc. ~tes.whileitcanreversihlyraisethemicmnueleusrateillspermatogeniecells. [KEYwom~slMe(1dlx)r(PstmneAcetate;malerats;bonenlalTowpolychromaticerythroe ytes;spermatogenic(.ells; micronllf.1Pl1P.IS"at 男性激素避孕机制在于抑制下丘脑一垂体一性 腺轴系,抑制促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌,可 以干扰精子发生而达到无精子症或严重少精子症: 已经有大量实验证明超生理剂量的孕激素对下丘脑 王收稿日期:2003一一22;修订日期:2003—06,04 作者简介:贾悦I1974一),男.南通市人,主治医师/讲师,在读博士.研究方向:内分泌疾病基因治疗 Tel:025—3714511—6530.E—mail:dixiajia~'lljI】nledu.CI1 一 l07— 癌变.畸变?突变2004年3月第16卷第2期Carcinogenesis,TeratogenesisandMutagenesisVol16No2Mar.,2OO4 一 垂体有负反馈抑制,提示孕激素可与雄激素配伍 使用于男性避孕.在印尼的临床试验中雄+孕激素 获得明确抑制生精的效果[】].但目前尚缺乏充分的动 物实验数据来支持雄/孕激素避孕的效果和机制.近 来有较多研究发现孕激素除上述负反馈抑制垂体促 性腺激素释放外还可能直接作用于睾丸及附睾发挥 局部的节育效应].本文以大鼠动物模型观察MPA 对大鼠生精功能和骨髓及生精细胞微核率的影响. 1材料与方法 1.1实验动物8周龄雄性Sprague—Dawley大鼠 50只,体重(209.3?9.5)g,合格证号:苏动(环) 97002.分笼饲养,随意饮水,自由进食. 1.2药品 醋酸甲羟孕酮混悬液(Meddroxyprogesterone acetate,MPA,商品名:狄波一普维拉,Depo—Pmvem) 为法玛西亚普强公司比利时分厂生产(批号:CJ067/ 10/1995). 1.3分组处理50只大鼠随机分为4组:C组为 阴性对照组(给予生理盐水);P组为小剂量MPA 组(37.5mg/kg,每月一次);P:组为中剂量MPA组 (75mg/kg,每月一次);P组为大剂量MPA组(150 mg/kg,每月一次).每组给药均为3个月,每组中一 半动物在停药后即处死,另一半动物在停药后9个 月时处死.大鼠处死时摘取双侧睾丸称重. 1.4大鼠骨髓细胞微核试验与观察实验结束将 大鼠处死,取其左侧股骨,剔除肌肉,用咬骨钳钳开 股骨挤出骨髓并将骨髓悬浮于0.9%的生理盐水中, 1000r/mln离心5min,弃去上清液,向沉淀细胞中 滴加200tzl胎牛血清并混匀.取细胞混悬液50l滴 在载玻片上推片,空气干燥后4?甲醇固定5min, 晾干后5%Giemsa染色20min,于油镜下每只大鼠 计数1000个嗜多染红细胞(PCE),观察含有微核的 PCE数,并计算其微核率;微核计数根据唐琪妮 等文献H判定:细胞膜完整,微核与主核完全分开, 形态呈圆形或椭圆形,边缘整齐,染色与主核一致, 微核直径在主核直径1/3以下. 1.5鼠生精细胞微核试验与观察参照刘启兰 等方法,略加改进.将动物左侧睾丸在冰面上去除 包膜和血管,用少量HBSS平衡液冲洗睾丸实质,参 照Steinberger和Gray的方法分离生精细胞与间质细 胞.将睾丸实质放人5IIll胶原酶消化液I(每的 DMEM液中含0.5mg胶原酶I和1.5mgBSA)中; 在34?,(8090)r/rain震荡条件下消化45rain.然 后在5ml酶液中加入20rnlDMEM液,充分吹打震 荡后置于冰面上5min;以200目尼龙网过滤获得去 除曲细精管管周细胞的曲细精管.将其放人15IIll 胶原酶消化液?(每mlDMEM液中含0.5mg胶原 酶I,10btgDNA酶,0.1mg大豆胰酶抑制剂和1.0 mgBSA)中,在34oC,150r/min震荡条件下肖化30 min.消化液用300目尼龙网过滤.滤液经800r/min 离心3min,收集沉淀,用3mlDMEM液稀释后取50 l滴在载玻片上,推片后空气干燥,4?乙醇一冰醋 酸(3:1)混合液固定5min,晾干后1‰丫啶橙一磷酸 缓冲液(PBS)(1:15,pH值6.8)染色2min,倾去染 液,用PBS冲洗至细胞呈绿色,于400×荧光显微镜 下计数生精细胞微核;微核计数标准同上. 1.6附睾精子计数和畸形测定采用江苏省计生 所林宁等建立的附睾尾部精子密度测定方法,计 算精子数与畸形率. 1.7统计方法实验测定结果以?s表示,数据 采用Studentt检验,检验水准a=0.05. 2结果 2.1停药后即处死的大鼠附睾精子计数和畸形率 的结果由表1可见各实验组大鼠附睾精子计数和 畸形率与空白对照组比较,差异有显着性(P> 0.05). 2.2停药后即处死的大鼠骨髓细胞微核率结果 由表2可见大鼠骨髓PCE的微核率与空白对照 组比较,差异无显着性(P>0.05). 2.3停药后即处死的大鼠生精细胞微核率结果 表1不同剂量MPA对大鼠睾丸重量,附睾精子计数和畸形率的影晌(i?s) Table1EffectofMPAonweightoftestes,sperm咖墒】gandspermmodalityofrats(?s) comparedwithcontrol,:P<0.05.*:P<0.01 .—— 108?-—— 癌变.畸变.突变2004年3月第16卷第2期Carcinogenesis,TemtogenesisandMutagenesisVol16No2Mar,20o4 表2不同剂量M队对大鼠骨髓细胞微核率的影响f4-s) bin:micronudeus;BMPE:bonemal'l'owpolychromaticerythrocytes 表3不同剂量MPA对大鼠生精细胞微核率的影响f?) Table3EffectofMPAonthe?am岫Ilcrateinspermatogeniccellsofratsf4-) bin:micronucleus;Sp:spemmtogenic c0lIl1)awithcontrol,*P<O.05,**P<0.O1 表4不同剂量MPA停药9个月后对大鼠生精细胞微核率的影响f?s) Table4EffectofMPAonthemicronucleusratein叩删t0cellsofrats船MPAdeprived9monthsf?) 由表3可见实验组大鼠生精细胞的微核率与白 对照组比较差异有显着性(P<0.05). 由表4可见停药9个月后实验组大鼠的睾丸重 量,精子计数,精子畸形率和生精细胞的微核率与空 白对照组比较差异无显着性(P>0.05). 3讨论 微核试验是检测外来化合物对染色体损伤的重 要方法,大量的对比实验证实其在敏感性和特异性 上与染色体畸变相当,但更加简便,快速,目前 已经在国内外得到广泛应用.本实验采用骨髓细胞 和生精细胞微核分析的方法观察避孕使用的孕激素 对染色体的影响. 迫于日益严重的人口压力,计划生育和避孕成 为控制生殖的主要手段.在男性避孕的研究中,激素 避孕有希望成为一种基本符合要求的避孕措施.已 发现单独长程使用较大剂量孕酮或合成孕激素在人 类男性和各种雄性动物中可引起生精抑制和睾酮水 平降低.因为孕激素对男性下丘脑一垂体一性腺轴 具有反馈调节作用抑制生精,而且孕激素除负反馈 抑制垂体促性腺激素释放外还可能直接作用于睾丸 及附睾发挥局部节育效应乜.】.多项研究证实,雄激素 与孕激素合用可以获得更强的抑制生精效应. 本实验对生精细胞计数的结果表明,单独使用 MPA显着抑制生精功能,升高精子畸形率.这与本小 组以往的实验结果一致口】. 本实验大鼠骨髓微核试验结果表明,本实验使 用3种剂量的MPA没有增加大鼠的骨髓细胞微核 率,与空白对照组比较P>0.05.生精细胞的微核实 验结果显示,达到抑制生精作用剂量的MPA使大鼠 的生精细胞微核率增加,且与空白对照组比较P <0.05;但在停药9个月后,实验组大鼠的生精细胞 微核率下降至空白对照组水平. 骨髓微核试验结果提示,抑制生精剂量的孕激 素对体细胞没有致突变性.因为本试验使用的孕激 素是具有抑制生精作用的超生理剂量,所以给药后 明显抑制大鼠的睾丸中睾酮的合成,严重破坏生精 需要的高浓度睾酮微环境从而抑制生精.在这种不 利的微环境中,生精细胞的分裂与成熟分化为精子 的过程严重受损,其中必然涉及染色体的稳定,所以 在用药后的动物观察到生精细胞微核率增加.在本 实验中,较大剂量实验组的精子畸形率高于阴性对 照组,且差异具有统计学意义,说明超生理剂量的孕 (下接113页) 一 1?一 癌变.畸变.突变2004年3月第16卷第2期 Carcinogenesis.TeratogenesismidMutagenesisVol16No2Mar?2Oo4 可能由于自然原因死亡或者小鼠的个体差异:体重 变化结果显示.除了阳性对照组小鼠的体重增长缓 慢之外,其它组小鼠的体重均呈明显上升趋势,试验 后的各组与阳性对照组之间均有统计学意义,与阴 性对照组之间均无统计学意义:说明苦参素对小鼠 体重增长并无明显抑制作用:外周血微核试验与精 子畸变试验阳性对照组明显高于阴性对照组,证明 本试验系统是可靠的:苦参素对遗传物质的损害程 度与给药时间,给药剂量均有一定的关系:关于苦参 素对遗传物质损伤的具体作用机制,对机体其它器 官的损害及苦参素的安全剂量问,尚有待于进一 步研究 参考文献: [1】王忠效.苦参素治疗乙型病毒性肝炎的基础性研究[J】. 传染病信息,2000.13(2):52—54. 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