反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究
孙红妹 刘哲伟 张霆
( ) 【摘要】 目的 针对柯萨奇病毒23 型 CVB基因组重要功能区设计系列反义寡聚核苷酸序列 , 3
通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用 。方法 通过病毒空斑形成试验及致细胞 病变作用 ,了解反义核酸抑制及阻断 CVB病毒感染细胞的能力 。结果 实验所设计的反义核酸中 3
S对感染 HeL a 细胞的 CVB病毒活性抑制作用较强 ,当病毒感染量为 1 MO I 时 ,病毒活性抑制率 CB1 3
高达 90 % ; S和 S均为 75 % ; S有 50 %抑制作用 ;而 S和 S以及非特异性对照序列对 CVBCB4 CB2 CB6 CB3 CB5 3 病毒基因基本没有任何作用 。结论 通过以上实验确定 S、S、S等较好的抗病毒反义核酸序 CB1 CB2 CB4
列 ,为进一步研究反义核酸抗病毒作用提供了重要的实验基础 。
【关键词】 反义寡聚核苷酸 ; 柯萨奇病毒 ; HeL a 细胞
Antisense ol igonucleotides resistance to coxsackievirus Binf ection in HeLa cells S U N Hong mei , L I U 3
Zhew ei , Z HA N G T i n g . Bei ji ng Cent ral L aboratory of I nf ect ion an d I m m u ni t y , Capi t al I nst i t ute of Pedi at rics , Bei ji n g 100020 , Chi n a
( ) 【Abstract】 Objective Antisense oligodeo xynucleotides ODNshold great p ro mise as t herapeutic agent s for t he t reat ment of many human diseases. Oligo nucleotides specifically hybrid wit h a selected
() sequence of RNA or DNA and inhibit t he flow of genetic informatio n DNA or RNAto p roteins. In accordance wit h t he p resent st udy , several oligo nucleotide sequences t hat targeted CVBRNA coding Vp, 3 4
( ) Vp, Vp, cleavage enzyme P2A or unt ranslatio nal regio n were designed for observatio n. Methods 2 1
Antiviral activities of t hese oligo nucleotides were evaluated by plaque reductio n assay and cytopat hic effect () CP E. Cells were also t reated wit h rando m oligo nocleotides as a specificit y co nt rol . Results Original
(ODNs , displaying sequence2specific inhibitio n ranging f ro m 50 % to 90 % were identified. Three ODNs at
) ) ( 5 micro M co ncent ratio n, which targeting at t he p yrimidine 2 rich t ract S, st ruct ural p rotein V P CB1 1( ) ( ) Sand initiatio n of t ranslatio n Swere shown to exhibit inhibitio n of viral infectio n 75 % to 90 % at CB4 CB2
1 MO I. There was o nly low antiviral activity in Sand S, and rando m oligo nucleotide were not found CB5 CB3
having antiviral activity. Oligo nucleotides in t his st udy were not to xic at 5 micro M co ncent ratio n. Conclusion A bet ter antiviral antisense oligo nucleotides as Sand S、S, could p rovide candidate CB1 CB4 CB2
antisense oligo nucleotides for t he t reat ment of CVBinfectio n. 3
() 【 Key words】 Antisense oligodeo xynucleotides ODNs; Co xsakievirus ; HeL a cells
柯萨奇病毒是引起人类呼吸道 、心血管及神经疾病 、肿瘤和炎症等疾病治疗中具有诱人的应用前
系统感染等疾病的主要病原之一 ,病情从轻微的上 ,反义核酸治疗 A IDS 和人类巨细胞病 景 。在国外
1 24 ( ) 毒 HCMV感染已进入临床实验阶段。国内也 呼吸道感染到致死性感染不等 。病毒性心肌炎及扩
已经对流感等病毒进行了反义 核 酸 抑 制 感 染 的 初 张性心肌病近 10 年颇为常见 ,而且发病率有不断上 5 ,6。以下重点探讨我们设计的反义核酸序列对探 升的趋势 ,严重危及人民生命健康 。目前对病毒感
柯萨奇病毒感染 HeL a 细胞的阻断作用 。 染尚缺乏特异 、有效的预防和治疗手段 ,研究特异性
抗病毒新药具有重要的现实意义 。反义核酸技术是 材料及方法 利用具有专一顺序的寡聚脱氧核苷酸 ,特异阻断目
1 . 病 毒 及 细 胞 : 实 验 所 用 病 毒 株 为 本 室 通 过 的基因的复制 、转录 、翻译 ,是一种新型的治疗方法 ,
CVBcDNA 感染性克隆 ,在转染细胞后获得 , 其病 3 具 有特异 、高效 、易人工合成等优势 。在病毒感染性10 毒滴度为 4 ×10pf u/ ml ,经传代后 , - 80 ?低温冰
箱保存 。使用时用无血清 einimum essential medium 作者单位 : 100020 首都儿科研究所 北京市感染与免疫中心实 ( ) M EM稀释病毒 。HeL a 细胞株由本研究所生化免 验室
10 10pf u/ ml 。本实验采用此稀释度的病毒 , 对抑制 疫室提供 ,细胞培养液为含 5 %, 10 %新生牛血清
的 M EM 。结果易于量化 。
表1 病毒空斑形成试验结果2 . 反义核酸 : 针对 CVB病毒基因组的调控序 3
( )空斑数 均值 病毒稀释度 列 、结构蛋白 、非结构蛋白及非编码区序列等分析 , - 4 > 200 5 ×10 (设计 6 组不同的反义寡核苷酸 由上海 Sango n 生物 - 5> 200 ×10 5 ) - 6 工程公司合成,序列如下 :> 200 5 ×10 - 7 S5′A GTA TA GGAA TAAAA T GAAA 3′ 150,200CB1 5 ×10 - 8 S5′T T GA GC TCCCA T T T T GC T GT 3′ 35 CB2 5 ×10 阴性对照 0 S5′C GT GCC T GACCAA T GGT GA T 3′ CB3
S5′CAAAC GTCA GC TCCA GGTC G 3′ CB4
S5′AA T GC GCCC GTA T T T GTCA T 3′ CB5 二 、反义核酸阻断病毒空斑形成效果 S5′C TCC T GGGGTA GTA T TCAC T 3′ CB6 用病毒空斑形成阻断试验显示反义核酸对病毒
感染细胞的抑制 。应用所设计的 6 种反义寡核苷酸 病 毒 为3 . 病 毒 空 斑 形 成 试 验 : 稀 释 CVB 3- 8(μ) 5 mol/ L 处理 HeL a 细胞 ,然后用 5 ×10 稀释度 - 4- 8 (10 ,10 ,分别加入 6 孔细胞培养板 细胞数 2 × 的病毒感染细胞 。同时设病毒 、正常细胞及非特异 6 μ) 10/ 孔 ,病毒量 200l/ 孔,37 ?,5 % CO孵育 1 h , 2 ( ) 寡核苷酸 rando m对照 。结果见表 2 。 () 加入0 . 7 %琼脂 1 ml/ 孔,再孵育 72 h 。1 %结晶紫
染色 ,观察结果 。 - 8 表2 5 ×10 稀释度病毒空斑阻断试验结果 μ4 . 空斑阻断试验 : 用浓度为 5 、 mol/ L 的 SCB1 ( μ)反义核酸 5 mol/ L ( )空斑数 均值 S、S、S、S和 S分别加入 HeL a 细胞培养CB2 CB3 CB4 CB5CB60 正常细胞对照孔
S1 CB1 孔中 ,37 ? 5 %CO孵育 72 h ,固定 、染色后观察结 2 S5 CB2 果 。 S12 CB3 ( ) 5 . 病毒致细胞病变效应 CP E: 稀释病毒使最 S1 CB4
S6 CB5 ( ) 后细胞的感染量 MO I为 10 、1 、0 . 1 、0 . 01 4 种病毒
S3 CB6 μ稀释滴度 ,分别加入细胞孔中 ,每孔 200 l 。同时设 rando m 25 正常细胞对照孔 。病毒感染 1 h 后 ,洗去病毒加正 35 病毒感染对照孔
常培养基 ,37 ? 5 %CO孵育 72 h 。观察结果 。 2
6 . 反义核酸抑制病毒致细胞病变效应 : 将合成 三 、病毒致细胞病变效应
6 μ的寡聚核苷酸稀释至 5 mol/ L ,分别加入培养板的 根据每个培养孔细胞数为 2 ×10,及病毒空斑
10 细胞孔中 ,每孔 1 ml 。37 ? 5 %CO孵育 6 h 。 2 形成单位 4 ×10pf u/ ml , 可 算 出 从 原 病 毒 液 中 取
7 0 . 01 、0 . 1 、1 . 0 、10 MO I 4 种感染量的 CVB病 3 μμ0 . 5l ,稀释到 200l ,其病毒量为 2 ×10pf u/ ml ,即 分别感染 HeL a 细胞 ,37 ?5 %CO孵育 1 h ,合成的 2 感染复数为 10 MO I 。继续稀释病毒 ,用 4 种不同感
μ6 种寡聚核苷酸分别稀释至 5 mol/ L ,再加入已感 染量的病毒感染 HeL a 细胞 ,培养 72 h 后 ,细胞存活 染不同滴度病毒的细胞孔 ,每孔 1 ml ,37 ? 5 %CO2 情况见表 3 。
孵育 72 h ,观察结果 。 表3 不同滴度病毒感染细胞情况
( )病毒感染量 MO I 活细胞量 结果 0 . 01 少许
0 . 1 无 一 、病毒空斑形成试验 1 无 7 CVB 感染性克隆的构建 、转化见文献。转化 10 无
无病毒细胞阴性对照全部后 3 日收获成熟病毒 。按表 1 中所列滴度进行不同
稀释 。待细胞在培养板底面生长近 95 %时 ,进行空
斑形成实验 。 3 可见 ,当病毒 MO I 为0 . 01时 ,病毒 RNA由表
- 8 进入 HeL a 细胞仍有部分存活 , MO I 为0 . 1 时 ,培养 由表 1 可见 5 ×10 稀释病毒感染细胞后形成
72 h 细胞几乎全部死亡 。35 个空 斑 , 可 计 算 出 此 病 毒 空 斑 形 成 单 位 为 4 ×
和死亡 ,可观察细胞的感染程度 。我们用浓度是 5,反义核酸有明显的抑制病毒感实验结果显示 μ mol/ L 的 6 种 反 义 核 酸 分 别 对 0 . 01 、0 . 1 、1 . 0 、10染细胞的作用 ,但针对病毒不同区域所产生的效果 MO I 感染量的病毒所感染的细胞进行实验 ,观察其 也不同 。由表 2 可见 ,在病毒空斑阻断试验中 , SCB1 保护细胞的效果 ,结果见图 1 。 抑制病毒 感 染 的 能 力 较 强 , S、S和 S次 之 , CB4 CB6 CB2
S、S的抑制病毒能力最差 。在反义核酸对病毒 CB5 CB3
致细胞病变效应的影响中 ,当病毒的感染量为0 . 01 、
0 . 1 MO I 时 S和 S抑制病毒效果很好 ,无死亡 ; CB1 CB4
随病毒感染量逐渐增加至 10 MO I , S对病毒仍有 CB1
较好的抑制作用 ,而 S则随病毒感染量的增加 ,抑 CB4
制病毒的效果逐 渐 减 弱 , 有 一 部 分 细 胞 出 现 死 亡 。
S、S抗病毒效果稍差 ,当病毒感染量为0 . 01 个 CB2 CB6
MO I 时有少许细胞死亡 , 病毒滴度增加时 , 死亡细
胞随之增加 。S和 S对病毒基 本 无 抑 制 作 用 , CB3 CB5
当病毒感染量为 1 MO I 时 ,细胞几乎全部死亡 。 图1 6 种反义核酸的抗病毒效应 根据上 述 实 验 结 果 , S对 感 染 HeL a 细 胞 的 CB1
CVB抑制作用最好 ,S、S和 S的抗病毒作用3 CB2 CB4CB6以上结果显示 ,根据不同区域设计的反义核酸 ,而 S 和 S 以及非特异性对照序列对 CVB稍差 CB3 CB5 3 对病毒的抑制能力不同 ,其中 S、S、S和 SCB1 CB2 CB4 CB6 病毒基本没有作用 。这与作用部位有关 ,我们准备 均显现出对病毒感染的抑制作用 ,结果与空斑形成 在不同病毒复制水平及量效关系上进一步研究 。此 抑制实验显示出一致性 。S的抑制效果 > 90 % , CB1 外 ,我们在反义核酸对细胞的毒性观察中 ,未见明显 S也达到 75 % , S在 0 . 1 MO I 时显示出 > 90 % CB2CB4 的细胞损伤 ,提示了反义核酸的使用安全性 。 的抑制效果 ,而在1 . 0和 10 MO I 时也显示出 75 %和
参 考 文 献 50 %的抑制率 , S抑制率为 50 % 。同时我们设立 CB6
正常细胞对照组 ,设随机合成的寡核苷酸为非特异 1 Stein CA , Chen YC. Antisense oligo nucleotides as t herapectic agent 2 Is t he bullet really magical ? Science , 1993 ,261?100421012 . 性对照 ,结果未发现任何保护作用 ; 此外 ,反义核酸
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( ) 收稿日期 :2000203217蛋白 、非 结 构 蛋 白 及 非 编 码 区 序 列 已 基 本 确 定 清
7,本实验在对 CVB较深入的分子生物学研究楚 3