蛋白质水解度的测定

蛋白质水解度的测定 中 国 油 脂 2000 年第 25 卷第 6 期 176 文章编号: 1003 7969( 2000) 06 0176 02 蛋 白 质 水 解 度 的 测 定 郭兴凤 ( 郑州粮食学院食品工程 系, 450052 郑州市嵩山南路 140 号; 作者: 女, 35 岁, 工程师) 摘要: 介绍了一种新的测定蛋白质水解度的方法, 该方法利用待测蛋白样品的完全水解液做为 茚三酮比色的标准样品测定蛋白质的水解度, 并和常用的几种测定水解度的方法进行了比较。该 种方法消除了由一种氨基酸做为对照样品所带来的测定误差, 是一种简单易行的测定水解度的方 法。 关键词: 蛋白质; 水解度; 测定 中图分类号: TQ645 9+ 9 文献标识码: A 水解度是指蛋白质分子中由于生物的或化学的 水, 溶解, 放棕色瓶中保存, 应每次使用前配制。 水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例。 1 2 2 pH8 缓 冲溶 液: 0 2 molNa2HPO4 94 7 ml 与 测定蛋白质水解度的方法很多, 常用的方法有三氯 0 2 molNaH2PO4 5 3 ml 合并, 混匀。 乙酸沉淀法、三硝基苯磺酸法[ 1] 、茚三酮比色法、甲 其他试剂见有关参考文献。 1 2 3 [ 2] [ 3] 醛滴定法 法等。甲 醛滴定法快速 简 、pH- stat 1 3 原料 菜籽蛋白 单, 但采用此法测定结果低于氨基酸理论含量[ 2] ; 茚 1 3 1 由低温脱脂菜籽粕制备, 蛋白质 三酮比色法由于采用的是单一氨基酸做标准, 而不 含量 71 1% 。 同的氨基酸对茚三酮的呈色度不同, 因此采用茚三 1 3 2 蛋白 酶 Flavorzyme, 由 Novo 公 司提供, 活力 [ 2] 酮比色法结果也有偏差 ; 三硝基苯磺酸法测定的 500 MG/ g。 2 分析方法 结果相对较准确, 但由于所用的试剂不易获得且分 析方法非常繁杂, 通常情况下采用此种方法的还不 2 1 完全水解蛋白液的制备 太多; 现在有许多研究采用 pH- stat 法, 这种方法也 取菜籽蛋 白 100 mg, 放入特制的反应瓶, 加入 有误差, 在工业生产中可用于监控水解终点, 但在研 100 ml 6 mol 盐酸, 拧紧瓶盖, 放入 130 烘箱中水解 究中则需要用其他的方法进行校正。 24 h, 冷却, 过滤, 滤液真空浓缩至 0 5 ml 左右, 加蒸 本文介绍一种新的测定水解度的方法, 本方法 馏水 90 ml, 用 1 molNaOH 中和至中性( pH6) , 定容至 采用茚三酮比色法, 利用待水解原料的完全水解液 100 ml。 作为标准, 消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产 2 2 工作曲线的绘制 物的呈色度不同对测定结果造成的误差, 本方法是 取完全水解液 0 1 ml~ 1 0 ml 于 25 ml 比色管 [ 4] 的方法和现行的方法进行改 中, 蒸馏水稀释至 4 0 ml, 加 pH8 缓冲溶液 1 0 ml, 依据 Qin- Yun Chen 进, 使测定结果更接近真实值。 茚三酮溶液 1 0 ml, 混匀, 沸水浴加热 15 min, 冷却, 原料和试剂 1 蒸馏水稀释至 25 ml。570 nm 测光密度( 水作参比) 。 主要仪器 1 1 另取 100 mg 蛋白, 加水 100 ml, 振荡均匀后过滤, 取 751 分光光度计, 上海。 相应体积的滤液, 按上述方法测光密度值。相同体 试剂 积样品的光密度之差与蛋白质量做工作曲线, 取线 1 2 性部分做标准曲线。 1 2 1 茚三酮显色液: 2 g 茚三酮加入 100 ml 蒸馏 2 3 水解液水解度的测定 取水解后灭酶的水解液 1 ml, 稀释至 100 ml, 过 收稿日期: 2000 05 10 滤, 取滤液 1 ml~ 4 ml( 使测定值在工作曲线的线性 中 国 油 脂 2000 年第 25 卷 第 6 期 177 部分) , 加水至 4 ml, 加 pH8 缓冲溶液 1 0 ml, 茚三酮 3 1 结果 溶液 1 0 ml, 沸水浴加热 15 min, 冷却, 蒸馏水稀释 为了验 证此 种 方法 的可 行性, 本 研 究用 Fla 至 25 ml, 570 nm 测光密度( 水作参比) 。另取相同浓 vorzyme 对菜籽蛋白进行水解, 用同一种水解液采用 度未水解蛋白溶液 1 ml~ 4 ml, 按上述方法测光密 10% 三氯乙 酸沉淀法、甲醛滴 定法[ 2] 、茚三 酮比色 度法, 以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质含量, [ 2] 和本文所介绍的方法分别进行测定, 结果见附 图和附。 按下式计算水解度: A 3 2 讨论 ! V1 ! 100 ! 100 DH ( % ) = 1 000 ! W V2 由结果可以看出, 采用三氯乙酸沉淀法测定的 式中: A: 查表得蛋白质的毫克数; 结果最高, 这是由于三氯乙酸可溶物中除了氨基酸 W: 称样重( g) ; 外还有小分子的肽; 采用甲醛滴定法和茚三酮比色 V1: 水解液的总体积( ml) ; 法( 亮氨酸做标准) 测定的结果基本相同; 采用本文 V2: 显色时所用稀释液的体积( ml) 。 所介绍的方法测定的结果高于甲醛滴定法和茚三酮 附表 不同的测定方法测定的水解液水解 度结果 比色法; 这是由于此种方法采用待水解的蛋白质的 完全水解液作为标准溶液, 消除了由于蛋白质水解 方 法 1 2 3 液中不同的氨基酸对反应试剂的响应不同所带来的 三氯乙酸沉淀法 39 2 45 4 49 5 误差。因此, 采用此种方法测定的结果最接近实际 甲醛滴定法 15 8 20 7 24 8 值。此种方法所用的仪器药品都比较简单, 在一般 茚三酮比色法( 亮氨酸 做标准) 15 5 21 8 24 9 的实验室中都可以进行测定。本研究为蛋白质水解 茚三酮比色法( 完全水解液做标准) 17 5 24 3 28 6 度的准确测定提供了一种新的方法。 参 考 文 献 [ 1] Alder- Nissen J. Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by T rinitrobenzenesulfonic Acid [ J] . J. Agric Food Chem. , 1979, 27: 1256 1262 宁正祥主 编. 食品 成分 分析手 册[ M ] . 北京: 中 国轻 工 [ 2] 业出版社, 1998: 119 124 Alder- Nissen J. Enzymatic Hydrolysis of Food Protein[ M ] . [ 3] Elsevier Applied Science Publishers. London, 1986: 12 14 Qin yun Chen. Effect of Amide contents in wheat gluten hy [ 4] drolysates on the thermal flavor generation, ph. D. thesis, Rut gers university, U. S. A, 1995: 54 56 附图 不同方法测定的水解度 结果和讨论 3 Determination of Hydrolysis Degree of Protein GUO Xing feng ( Zhengzhou Grain College, Zhengzhou, 450052) Abstract: A new way to determine the hydrolytic degree of protein hydrolysates ( DH) was investigated in this pa per. In the ninhydrin test, sample completely hydrolated by hydrochloric acid was taken as a reference solution. Comparing with the results of several other methods usually usued, this method eliminated the error of using amino acid as the refer ence, which was common in the tradational way. Key words: protein; hydrolysis degree; determination