干细胞分泌上清的制备及抗氧化和抗皮肤光老化活性研究（可编辑）

干细胞分泌上清的制备及抗氧化和抗皮肤光老化活性研究（可编辑） 干细胞分泌上清的制备及抗氧化和抗皮肤光老化活性 研究 暨南大学硕士学位论文 摘要 目的: 1.收集并制备人脐带间充质干细胞无血清培养上清USFM。 2.研究 USFM 对体外培养的人真皮成纤维细胞HDF因紫外损伤的保护作用和对小鼠 皮肤因紫外辐照损伤的抗光老化作用。 方法: 1.从人脐带中分离培养脐带间充质干细胞UC-MSCs,传代培养,收集干细胞分泌无 血清上清,制备 USFM。 2.建立 UVA 损伤 HDF 损伤模型。MTT 法检测 USFM 对 HDF 细胞生长作用及增殖作 用浓度。 3.室内紫外照射建立昆明小鼠皮肤光老化模型,免疫组化染色观察小鼠皮肤结构变化, 测定小鼠体内血浆中 SOD酶活性、谷胱甘肽还原酶(GSH-PX)酶活性、丙二醛含量。 结果: 1. USFM 在蛋白质浓度?400μg/ml 时,对 HDF 细胞无明显的细胞毒性。20μg/ml 的 USFM 对 HDF 细胞生长具有显著的增殖效果。USFM 预处理的 HDF 细胞经紫外辐射后细 胞存活率为 86.4%?1.10,与模型组相比64.35%?3.22,具有显著性差异。 USFM 20 μg/ml、 10μg/ml 预处理的 HDF细胞内 SOD酶(超氧化歧化酶)活性分别是 42.95?1.15U/ml、 38.74 ?0.53 U/ml,与模型组 HDF细胞内 SOD 酶活性相比 21.31?1.31 U/ml,具有显著性差异。 2.成功建立小鼠光老化模型。老化的皮肤组织出现成纤维细胞损伤甚至破碎,弹力纤 维和 I、?型胶原纤维断裂,排列紊乱,弹力纤维样物质异常增生,同时伴有单核炎症细 胞的浸润;体内 SOD 酶活性显著下降,为 7.26?2.24U/ml,MDA(丙二醛)异常堆积, 为 25.93?1.16nmol/ml。外用 USFM 可以减轻皮肤光老化,胶原纤维虽有一定量的增加, 但是排列整齐,同时炎症细胞浸润明显减少,与模型组比较,血浆中的 SOD 酶、谷胱甘 肽过氧化物还原酶(GSH-PX)显著增高,MDA含量显著减少。USFM 20μg/ml、 10μg/ml 预处理的小鼠体内 SOD酶(超氧化歧化酶)活性分别是 53.3?5.99U/ml、 37.26?2.24U/ml, 与模型组 HDF细胞内 SOD酶活性相比 7.26?2.24U/ml,具有显著性差异。 结论: 1.从医疗废弃物人脐带中分离得到间充质干细胞。 I 暨南大学硕士学位论文 2.UVA能抑制 HDF细胞生长,导致细胞凋亡与坏死。 3.UVA+UVB照射皮肤,能加速皮肤的光老化,削弱皮肤的抗氧化防御功能。 4. USFM 具有良好的抗氧化作用。 关键词:人脐带间充质干细胞 人真皮成纤维细胞紫外线 光老化 干细胞 分泌上清 II 暨南大学硕士学位论文 Abstract Objectives: 1. Collection of serum-free cultur supernatant of mesenchyma stem cells and preparation USFM2. Inwestigation the protective effect of the USFM on human dermal fibroblastHDF exposed to ultraviolet A rays, has and the protective effect in the condition of skin lesion caused by imitated sunlightUVA95% and UVB5%Methods: 1. Mesenchyma stem cells were separated from human umbilical cord, and collect serum-free cultur supernatant of the cells to study its anti-light aging effect on the skin2. Separate and culture HDF to build the in vitro model of cell lesion caused by UVADetermine the toxicity of the cultur supernatant to HDF and the concentrations of promoting proliferation of HDF by MTT method 3. Firstly build the in vivo model of cutaneous photo-aging by imitated sunlight, and then observe skin texture changes by Hematoxylin-Eosin staining. Besides, detect the activity of SOD, GSH-PX, MDA in the plasma of mice by biochemical method and observe changes of collagenous fiber in corium Results: 1. The culturing supernatant of stem cells has no obvious toxic effect on HDF with the protein concentration less than 400 μg/ml. When the protein concentration was 20 μg/ml, the supernatant significantly promote the proliferation of HDF. In the test of HDF lesion by UVA, the survival rate was 86.4%?1.10 in the group of HDF with pre-treatment of the USFM, which has significant difference , compared to the model group64.35%?3.22. The activity of SOD inside the cells in high dose of stem cells’ secretin group was 42.95?1.15U/ml, and the activity of SOD in low dose of stem cells’ secretin group was38.74?0.53 U/ml, which has significant difference , compared to the model group 21.31?1.31 U/ml 2. Test in vivo showed that light-exposed skin of mice, whose back hair was cut out, presented typical light aging, following the ultraviolet rays UVA+UVB exposed scheduleObservation of pathological sections of the skin showed that fibroblast injured and even broke up; III 暨南大学硕士学位论文 elastic fibers, type I and type ? collagenous fibres ruptured and disorganized; and elastic fibers-liked substances abnormally grew with the infiltration of mononuclear inflammatory cellsBiochemical test of plasma showed that the activity of SOD in vitro significantly fell, it was 7.26 ?2.24U/ml , and MDA accumulated abnormally, it was 25.93?1.16nmol/ml. If the skin was pre-treated with the culturing supernatant of stem cells 30 min before exposing, cutaneous light aging could be alleviated. Although collagenous fibres grew a little bit, they were in orderIncrease of collagenous fibres would be good for anti-wrinkle, which was in accordance with the results of HE staining. At the same time, infiltration of inflammatory cells greatly reducedCompared to the model group, the activity of SOD and GSH-PX in the plasma remarkably increased, but MDA remarkably decreased. The activity of SOD inside the mice in high dose of stem cells’ secretin group was53.3?5.99 U/ml, and the activity of SOD in low dose of stem cells’ secretin group was37.26?2.24 U/ml, which has significant difference , compared to the model group 7.26?2.24U/mlConclusion: 1. Mesenchyma stem cells were separated from human umbilical cord2. UVA can inhibit the growth of HDF cells, and even leads to cell apoptosis and necrosis3. Exposed to UVA+UVB can accelerate cutaneous photo-aging, destroy the structure of dermis, weaken the defensive function of antioxidation, and enhance oxidizing lesion. When harm of ultraviolet exceeds instinctive reparing function of the skin, photo-aging occurs4. There are plenty of antioxidants in the serum-free culturing supernatant of mesenchyma stem cells, which maybe include growth-promoting cell growth factor. They have good ability of antioxidation, which provides certain study basis to further use of the culturing supernatant of stem cells to other medical treatmentKey works: human umbilical cord mesenchyma stem cells; human dermal fibroblast; ultraviolet; photo-aging; culturing supernatant of stem cellsIV 暨南大学硕士学 位论文 目录 摘要..I AbstractIII 第一章 前言..1 1干细胞的研究现状1 1.1 干细胞研究背景. 1 1.2干细胞研究在疾病治疗中的应用前景. 1 1.3脂肪间充质干细胞(ADSC)及其分泌因子的抗氧化的研究现状2 2自由基与紫外线的研究.5 2.1 自由基学说及其产生与种类 5 2.2 紫外线的研究概况 6 2.3 皮肤的氧化损伤与衰老的关系. 7 2.4 抗衰老研究现状. 8 3. 本研究的目的和意义. 9 4.研究创新点:. 9 5.实验技术路线 10 第二章 USFM 的制备及促 HDF细胞生长评价 11 1.实验材料及试剂: 11 2 主要仪器. 11 3 实验方法.12 3.1人脐带间充质干细胞、真皮成纤维细胞的分离培养. 12 3.2 USFM 的制备12 3.3 USFM蛋白质浓度测定14 3.4 USFM 对人真皮成纤维细胞生长的影响 14 3.5静置培养不同代 USFM 对人真皮成纤维细胞生长促进作用的比较 14 3.6 静置培养不同时间收集 USFM 对 HDF 细胞生长促进作用的比较. 15 3.7 不同诱导条件诱导 USFM 对 HDF细胞生长促进作用的比较. 15 3.8 实验结果统计方法. 15 4.实验结果..16 4.1 人脐带间充质干细胞和人真皮成纤维细胞的分离培养16 V 暨南大学硕士学位论文 4.2 USFM 蛋白质浓度测定结果16 4.3 USFM 对 HDF细胞生长的作用. 17 4.4 USFM 和 HDF无血清上清对 HDF生长作用 18 4.5 不同培养时间点收集的 USFM 对 HDF 细胞生长的作用. 19 4.6 不同物理刺激因素诱导的 USFM 对 HDF 细胞生长的作用 20 第三章 USFM 体外抗紫外线辐射实验..21 1.实验材料及试剂:21 2 实验方法.21 2.1紫外线对人真皮成纤维细胞生长的影响 21 2.2 USFM 对紫外线损伤人真皮成纤维细胞的保护作用21 2.3实验结果统计方法23 3.实验结果..23 3.1紫外线辐射对 HDF生长的影响:23 3.2 USFM 对紫外线损伤 HDF细胞的保护作用结果:. 24 第四章 USFM 对紫外线引起小鼠皮肤光老化的保护作用27 1实验材料及试剂..27 2动物饲养及实验分组27 3 光老化动物模型的建立及其 USFM 对皮肤的保护实验28 4 动物模型的检测及其实验效果检测..28 4.1 动物血浆中 SOD 酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)含量 的测定28 4.2、组织学鉴定小鼠光老化模型及其 USFM 抗光老化效果. 31 4.3 实验结果统计方法. 34 5.实验结果..34 5.1 紫外线损伤对小鼠体重变化的影响:. 34 5.2 实验小鼠血浆中 SOD酶活性. 35 5.4 实验小鼠血浆中 GSH-PX 活性37 5.5 受试小鼠皮肤结果:38 5.6 病理组织学检验结果39 5.7 组织中各胶原纤维实验结果. 40 VI 暨南大学硕士学位论文 第五章 讨论42 结论及展望..46 参考文献47 硕士期间发论 文……………………………………………………………………………53 致谢……………………………………………………………………………54VII 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 1干细胞的研究现状 1.1 干细胞研究背景 干细胞研究始于 20世纪 60年代,其发展令人瞩目。1998年,美国威斯康辛麦迪逊大 学汤姆逊教授领导的课组,率先成功地建立了人类胚胎干细胞系,这一研究成果被誉为 干细胞研究的里程碑,1999 年 12 月干细胞研究在美国《science》杂志公布的年度十大科 学成果中名列榜首。随着细胞生物学实验技术的发展,干细胞研究的领域在 不断的拓宽和 深入。目前干细胞涉及了几乎所有的生命科学和生物医药领域,因为干细胞在细胞治疗、 组织器官修复、发育生物学、药物学等方面的应用前景极为广阔,因此发达国家投入大量 的人力物力加紧研究开发。此后,干细胞领域的研究一直成为生命科学研究的前沿和热点。 干细胞的研究正在成为人类疾病治疗的新曙光。 干细胞具有的生物学特征:1 具有自我更新和维持的能力。其细胞分裂方式有两种, 一种是非对称分裂方式,即其中一个细胞保持亲代的特征,仍作为干细胞保留下来,另外 一个子细胞不可逆的分化为功能专一的终端细胞;另一种是对称式分裂,形成两个相同的 干细胞。2 具有多向分化潜能,在外界诱导因素条件下,分化为各种不同类型的组织细 胞。3 干细胞属于未分化细胞,终生保持未分化或者低分化特征。4 可连续分裂几代, 并可在较长时间内处于静止状态。5 干细胞分裂周期慢,绝大多数干细胞处于 G 期。 0 1.2 干细胞研究在疾病治疗中的应用前景 1.2.1 干细胞在癌症治疗中的研究 目前干细胞应用中癌症治疗昀为广泛,尤其是血癌。干细胞治疗白血病成功与否关键 取决于干细胞能否消灭已经癌变的白细胞,用健康的细胞替代它们,这一研究目前已经在 临床治疗上取得的重大进展并广泛使用。 1.2.2 干细胞在糖尿病治疗中的研究 胚胎干细胞是全能干细胞,可以分化为任何类型的细胞和组织,其在糖尿病治疗中具 有应用价值。研究表明人胚胎干细胞在体外培养和悬浮培养都能分化为表达胰岛素的阳性 细胞,其他多种胰岛β细胞标志均为阳性,提示人胚胎干细胞也可以分化为胰岛β细胞, 1 暨南大学硕士学位论文 [1] 从而发挥治疗糖尿病的作用 。王爱红等人研究了人脐带间充质干细胞向胰岛细胞的分化, 研究结果表明,人脐带间充质干细胞在体外的微环境中具有向胰岛样细胞分化的潜能,为 [2] 干细胞进一步应用于糖尿病的治疗提供了更为广泛的材料来源与实验依据 。 1.2.3 干细胞在心血管疾病治疗中的研究 冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病、心肌梗死、原发性高血压、心肌病等心血 管疾病的共同特点是有完整舒缩功能的心肌细胞数量相对减少,患者对于常规的药物治疗 [3] 反应极差,而干细胞移植作为一种新的治疗方法,极具发展潜力。 2001年,法国 Menasche 等人进行世界首例自体骨骼肌成肌细胞移植治疗了 10 例有不同程度心衰的冠心病患者。 [4] Leo Timmers 等人用人脐带间充质干细胞条件培养基修复心肌梗死,干细胞应用于心血管 疾病的研究前进一大步,实验表明,可以脱离直接注射干细胞,应用干细胞的旁分泌机制 来诱导受伤的心肌细胞进行自我修复。 在 2007 年岁末,日本和美国两个课题组相继运用基因修饰技术,对普通人的皮肤成 纤维细胞导入了 Oct4、nanog、sox2 等基因,结果发现,成纤维细胞经过基因重新编程, 具备了人类胚胎干细胞的特性。这一研究成果震动了全世界,美国政府为此投入 30 亿美 元资金,以继续对该课题的深入研究。干细胞研究的这一成果,大大缩短了将人类胚胎干 细胞应用于临床的距离。根据干细胞的来源可以分为胚胎干细胞和成体干细胞,间充质干 细胞是成体干细胞中的一大类。目前对骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞均有比较多 的研究,脐带间充质干细胞也有一定的认识和应用研究。 1.3 脂肪间充质干细胞(ADSC)及其分泌因子的抗氧化的研究现状 近年来再生医学成为众多医学研究工作者的研究重点,再生医学即应用自身的干细胞 或者生长因子来修复自身受伤组织。脂肪间充质干细胞因具有多向分化的性质而被应用, 其分泌的生长因子,包括血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞 生长因子(HGF)和转化生长因子,这些细胞生长因子能控制或者维持受伤组织细胞,引 导其自身修复。目前,ADSC抗氧化的研究不多见,但是已经有部分研究显示干细胞分泌 [5,6] 的细胞因子对氧化损伤具有保护作用。 IGF能减少成纤维细胞与肠上皮细胞的氧化损伤 ; HGF对谷胱甘肽缺乏症引起的视网膜色素上皮细胞氧化损伤有保护效果。白 介素-6(IL-6) [7] 能减少双氧水引起的上皮细胞的死亡率 。这些研究均表明ADSC具有抗氧化作用 Won-Serk Kim 等研究表明,脂肪间充质干细胞及其条件培养基(ADSC-CM)能够促 进受伤组织中成纤维细胞中胶原蛋白的合成和转移。ADSC-CM通过下调B 黑色素瘤细胞 16 2 暨南大学硕士学位论文 中酪氨酸及酪氨酸相关蛋白表达从而降低黑色素的形成。ADSC及其分泌的生长因子对 [8] UVB引起的成纤维细胞也具有保护作用 。临床研究表明,注射自体分离的脂肪间充质干 [9] 细胞,能使真皮厚度增加20-30%,同时减少皱纹形成 。这些研究都表明脂肪间充质干细胞 [10] 及其条件培养基具有抗皮肤光老化的作用。干细胞应用于再生医学应该具备的几点 : 1、 能够短时间内得到大量扩增的细胞。 2、 取材方面尽量减少供者的创伤。 3、 所获得的干细胞要能在经典的实验方法下分化为多种体细胞,并具有重复性。 4、 在干细胞移植到自体或者异体受者时,具有低免疫原性。 5、 能够在比较权威的企业指导下生产。 无论是骨髓间充质干细胞还是脂肪间充质干细胞,在取材方面都无异于给供者带来一 定的创伤,而使用脐带间充质干细胞的优点是利用了医疗的废弃物脐带,不会给供者带来 任何伤害。实验过程中发现,脐带间充质干细胞非常容易获得,且容易大量扩增,据研究 表明, UC-MSCs 还具有极低的免疫原性,因此比上述两种间充质干细胞更适合于再生医学 应用。 尽管干细胞的临床应用已经取得众多的研究进展,但是干细胞具有致畸致瘤的潜能; 干细胞注射到体内,很难控制其分化的方向,有研究表明,干细胞在体外长期培养,再注 射到体内,致使其致畸致瘤的几率增加,这也是目前干细胞临床研究停滞不前的一个重大 阻碍。 1.4 干细胞条件培养基研究现状干细胞移植已被广泛应用于多种疾病的治 疗,其作用机理分为两种,一种是干细胞分 化为特定的功能细胞组织替代原来受伤组织,一种是通过干细胞旁分泌机制分泌的细胞因 [57] 子诱导受伤组织自己修复。Siu Kwan Sze 等研究了人胚胎干细胞条件培养上清。他们通 过蛋白质多维电泳技术和细胞因子抗体芯片分析发现,人胚胎干细胞条件培养上清中包含 有 201种独立的基因产物,其中 86-88%可以通过定量 RT-PCR技术检测到。这些基因产物 主要可以分为三大类:包括新陈代谢、防御反应和组织分化等。同样这些基因产物可以激 活不同的信号通路,包括心血管生物学、骨骼发育和红细胞生成等,比如 Jak-STAT、 MAPK、 β转化生长因子等信号通路。因此,他们推断人胚胎干细胞条件培养上清可以用来治疗更 多的疾病而无需再通过干细胞移植。通过 LC-MS/MS和抗体分析得到的 201种基因产物如 下表所示: 3 暨南大学硕士学位论文 从上表可以看出,有众多的细胞因子具有促进细胞生长作用,其中包括 EGF、FGF等, 干细胞条件培养基的蛋白质组学分析为干细胞的旁分泌机制提供了更多的实验依据。研究 也发现,人胚胎干细胞要比成体干细胞具有更多的优越性,但是人胚胎干细胞和成体干细 胞条件培养基具有很大相似性。 [4] Leo Timmers 等研究了人胚胎间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)对心肌坏死的修 复作用。研究发现应用 MSC-CM 可以减少心肌细胞的氧化应激和氧化引起的心肌细胞凋 亡。他们采用 H O 诱导心肌细胞凋亡模式,实验结果表明,MSC-CM 对 H O 诱导的细胞 2 2 2 2 凋亡具有很好的保护作用,说明 MSC-CM 能有效清除氧自由基等对细胞的损伤。 [39] Won-Serk Kim 等人应用脂肪间充质干细胞条件培养基研究其抗氧化作用时发现,脂 4 暨南大学硕士学位论文 肪间充质干细胞条件培养基(ADSC-CM)亦能减少人真皮成纤维细胞(HDF)的氧化应 激能力,从而达到保护 HDF 细胞的目的。实验结果表明,经过 ADSC-CM 预处 理的 HDF 细胞酶抗氧化酶比对照组细胞内抗氧化酶活性要有显著提高,且呈现剂量依赖性。 2自由基与紫外线的研究 2.1 自由基学说及其产生与种类 2.1.1 自由基学说 [11] Harman D 于 1956提出自由基学说 ,认为自由基进攻细胞从而导致机体衰老。维持 体内适当的抗氧化和自由基水平,可以推迟衰老和延长生命。氧自由基(oxygen free radicals, OFR),又称活性氧reactive oxygen species, ROS,是昀为常见的自由基,其主要来源有两 个方面,一是内源性自由基,即机体在代谢过程中产生的自由基;一是外源性自由基,包 括各种大气污染物质,电离辐射,化学药物等引起的各种物质。研究表明人体内 90%以上 [12] 的自由基均属于氧自由基 。 [13] 自由基的三个特点 :(1)寿命短。因其活泼的化学性质,自由基存在的时间很短, -6 -8 仅在 10 -10 s 内就发生化学反应而消失。伴随自由基反应,生物体内存在可变价的金属离 子在其诱导下,其配对电子的形成同时又引发其他物质电子的得失,所以在此自由基消失 的同时新的自由基也产生,因此该反应往往在体内是一个连锁式反应。 (2)顺磁性:由于 共价键断裂产生的孤独电子具有自旋性,则在其周围产了磁场,即磁自旋。因此在其他磁 场的作用下具有顺磁作用。 (3)化学反应的活泼性。由于自由基带有不成对的电子,具有 化学的电子配对趋势,因此极易发生获得电子或者消失电子的化学反应。 2.1.2 自由基对机体的氧化损伤作用 [14] 研究表明,自由基可以引起生物膜脂质过氧化及遗传物质DNA等的损伤 。因细胞膜 损伤,膜上配体与受体的结合将减少,ATP腺苷酸环化酶的活性受到抑制,而 cAMP合成 [15] 的改变将影响细胞总代谢 。线粒体内膜脂质过氧化将造成膜流动性差,酶活性改变,线 粒体DNA损伤,引起线粒体依赖性的细胞衰老。自由基可与核酸的碱基发生 化学反应,破 [2] 坏碱基,导致染色体变异、断裂与交联,从而改变遗传基因 ,这种损伤一般不易被降解 而被直接修复。 研究表明,胶原蛋白的溶解性随着年龄的增长而降低。氧自由基可以促使赖氨酰氧化 酶参与胶原蛋白的交联,使结缔组织发生物理或者化学性质的改变。 5 暨南大学硕士学位论文 2.1.3 自由基的清除 细胞正常代谢产生的氧自由基,既有细胞毒性,也有一些生物功能。正常情况,体内 具有多种清除氧自由基的酶,能保持体内氧自由基平衡。这类酶主要有超氧化歧化酶 (superoxide dimutase,SOD)、谷胱甘肽还原酶(glutathione peroxidase,GSH-PX) 。其次, 各种抗氧剂在清除自由基过程中也发挥着重要作用。 抗氧化酶包括: (1)SOD:超氧化歧化酶是体内歧化超氧阴离子自由基的一种抗氧化酶,可以分为 三类:CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。CuZn-SOD 主要存在于胞浆中,金属离子位于酶 的活性部位,直接参与酶的活性。Mn-SOD 存在真核生物的线粒体和原核细胞内。 (2)GSH-PX主要存在于线粒体中,它不直接清除自由基,但是可以清除脂质过氧化 物,抑制自由基的生成。硒(Se)是 GSH-PX 的主要活性成份,负责有机过氧化物的还原。 非酶抗氧化包维生素C、维生素E等各种具有抗氧化的小分子化合物。 2.2 紫外线的研究概况 紫外线(utltraviolet UV)包括三个波段: UVA320-400nm, UVB280-320nm, [16] UVC200-280nm 。UVA、UVB可以穿过大气层到达地面,在日光对皮肤的作用中,UVB [17] 占 75%-85%。其中 UVA 可作用到真皮层 。由于日益加剧环境污染,臭氧层逐渐变薄甚 至臭氧空洞的出现,皮肤直接暴露于紫外线的机会也越来越多,长时间过量的 UV 辐射可 导致皮肤严重伤害而难以治疗。皮肤细胞的 DNA损伤主要是由 UVB损伤引起的。控制皮 肤细胞生长和分化的 DNA 损伤以后可以诱发肿瘤。近年来人们对 UVA 的损伤已经渐渐加 强,同样能量的 UVA 比 UVB 作用小 100-l000 倍,但因为 UVA 波长较长, 可穿透表皮到 [18,19] 真皮乳头层,因此无论是 UVA或 UVB都会对人体造成损害 。 适量的日光浴对人体是有益的,但是过量紫外线照射对健康的危害已成为全球昀为关 注的重大环境与健康的问题之一。长波紫外线(UVA)在太阳光中占紫外辐射能量的近 95%。UVA 具有诱导多种细胞发生凋亡:通过活性氧(ROS)的介导间接发挥其生物学效 应。活性氧自由基在紫外线引起的皮肤光老化中起着重要的作用。 2.2.1 UVB 对人皮肤的损伤研究 UVB在日光中大约占5%左右,是皮肤疾病的主要引起者,包括非黑色素和黑色素皮肤 癌。UVB能穿透表皮至真皮大约160-180 μm。UVB辐射能够导致多种有害生物学反应,包 [20,21,22] [23] 括氧自由基、DNA损伤、皮肤过早老化和多种免疫疾病等 。UVB也是肿瘤诱导剂 、 6 暨南大学硕士学位论文 [24] [25,26] 肿瘤启动因子 或者致癌因素之一 。虽然皮肤具有自身酶和非酶机制来抑制因UVB引 起的有害因子,但是过度的UVB辐射能破坏皮肤自身的这种平衡从而导致各种皮肤病的发 [27,28,29] 生甚至皮肤癌 。 [30] 2.2.2 UVA 对人皮肤的损伤研究 在过去的研究中,认为长波紫外线(UVA)对人体是无害的,但是近年来越来越多的 研究表明,UVA 对皮肤的亦存在着伤害,且其伤害是比 UVB 更深,因为随着紫外线波长 的增加,其能到达皮肤的 1000μm。 首先,UVA能造成皮肤真皮层成纤维细胞胶原分泌减少,这种下降并不是抑制细胞生 长导致细胞数目少引起的,而是细胞本身合成胶原的功能下调,Pascualle Tallec应用亚红 2 斑剂量UVA 10 J / cm 照射成纤维细胞后发现?型前胶原的mRNA 降低, ?型前胶 原mRNA 保持同一水平,而?型前胶原约占总的真皮胶原的85 %。其次UVA照射能够产生 超氧阴离子、羟自由基和单线态活性氧等氧自由基,这些氧自由基能攻击处于液态中的细 胞,造成细胞严重损伤。当细胞自身清除氧自由基的能力与产生氧自由基失去平衡时,将 引起细胞内一系列变化:? 活性氧自由基直接与生物大分子反应,引起DNA损伤,蛋白 质变性,酶失活等;? 以共价键的模式结合到生物膜上,导致膜功能损伤;? 启动膜脂 质过氧化,使膜脂质疏水区羰基形成,导致亲水中心出现,膜通透性增加,造成线粒体肿胀, 内质网空泡形成。 2.3 皮肤的氧化损伤与衰老的关系 皮肤是人体的一道天然屏障,对保护人体的健康有着非同寻常的作用,同时皮肤亦是 女性美容的一项重要指标。为了保护皮肤在正常功能,减少因大气污染而造成的对皮肤损 伤已经成为国际上一个非常重要的研究领域。 目前很多学者认为机体或者细胞衰老的直接原因是活性氧介导的氧化损伤。氧化损伤 是因自由基进攻细胞从而引起细胞结构或者功能的变化。衰老是一种功能性和器质性衰退 的过程,且具有时间依赖性。 氧化损伤不仅是衰老的直接原因,而且伴随着衰老的过程,参与并加速衰老进程。有 研究发现,在果蝇和小鼠的睾丸细胞,随着年龄的增长,细胞线粒体会减少,同时线粒体 [31,32,33] 膜和线粒体 DNA 遭受自由基的攻击率也将增加 。细胞遭受内源性和外源性氧化损伤 的结果也将会随着细胞和集体的衰老变得更严重。皮肤细胞的生理功能旺盛,长期暴露的 外界环境中,昀早能够反映机体衰老的组织是皮肤。皮肤老化主要有两种形式,一是自然 7 暨南大学硕士学位论文 [34] 老化;一是光老化;而这两种衰老形式均与其氧化应激有关系 。自然老化是由于机体的 内在因素所引起,主要与细胞代谢中自由基的堆积有关,全部皮肤均会出现明显的皮肤弹 [35] 性下降、松弛等衰老表现 。自然老化在病理上的表现主要有:皮肤的表皮及真皮层厚度 变薄,真皮中的胶原纤维和胶原蛋白含量下降,但是胶原束排列整齐,临床上表现为皮肤 出现细密的皱纹。而光老化则是因为皮肤的暴露部位受到阳光中紫外线的照射所引起的 [36] 。虽然紫外线的照射对于皮肤合成 V 是十分必要的,同时 UVA 会促进细胞内产生活性 D 氧,造成氧化应激反应,破坏细胞结构和功能,活性氧在皮肤细胞中还可以激活金属基质 [37,38] 蛋白酶,从而使得真皮的胶原和弹性蛋白降解,表现出皮肤光老化的特征 。紫外线中 的 UVB能直接破坏细胞的 DNA。光老化皮肤病理学表现为表皮增厚,棘细胞排列紊乱, 真皮中的胶原含量减少,胶原纤维断裂,异常弹力纤维增生,苏木素-伊红(HE)染色显 示真皮浅层有无定形嗜碱性团块样物质的沉积,即特征性的光老化弹力纤维变性。临床上 主要表现为皮肤增厚及粗深的皱纹。 总之,根据自由基学说,氧化损伤是衰老的直接原因,同时也参与并加速了衰老的过 程,特别是皮肤的衰老,氧化损伤在其发生机理方面发挥重要作用,因此从目前的研究理 论看,皮肤的氧化损伤与衰老存在着密不可分的关系。 2.4 抗氧化研究现状 2.4.1 多酚类抗氧化 多酚普遍存在于植物中,包括水果、蔬菜、种子、花和树皮,尤其是洋葱、可可、葡 萄籽、绿茶、苹果和红酒中多酚含量极高;其次是柑橘类水果、草莓、樱桃和黄豆等植物。 这些植物中的多酚对紫外线引起的皮肤光老化具有良好的保护作用。 研究表明:没食子茶儿精可以减少因紫外线辐照引起小鼠皮肤和人皮肤中的过氧化氢 [40,41,42] ,同时也能减少白细胞的浸润。白细胞增加能引起体内笑气和过氧化氢量的增加, 研究表明,没食子茶儿精能阻断UVB引起的白细胞增多,从而抑制UVB引起的活性氧的增 [43,44] [45] 加 。茶多酚具有抑制光照引起的脂质体过氧化反应 ,绿茶茶多酚能显著抑制UVB引 起的DNA损伤;人皮肤用茶多酚后,UVB辐照产生的环丁烷嘧啶二聚体对茶多酚产生计量 [46] [47] 依赖性,说明茶多酚亦能减少人体皮肤免受紫外线的伤害 ; Camouse et al. 等研究发现, 绿茶和白茶茶多酚均能保护皮肤对紫外线的伤害,这种保护作用不但是对紫 外线的吸收或 者避光效果,而是这两种多酚均具有日光防晒系数。 2.4.2 维生素抗衰老的研究现状 8 暨南大学硕士学位论文 研究表明,VitminE 、VitminC、 VitminA 及 β 胡萝卜素因具有抗氧自由基效应而应 用于抗衰老等研究。VitminC 俗名抗坏血酸,是人体必不可少的维生素,具有极强的还原 性,不但能抗氧化,还参与细胞间质胶原蛋白合成,能维护细胞膜的完整性,把胞内氧化 [48,49] 性的谷胱甘肽还原成还原型的谷胱甘肽,在众多抗老化实验中用做阳性对照药 。 VitminE 俗名生育酚,本身极易被氧化,能捕捉体内脂质自由基、超氧自由基和类脂质自 [50,51] 由基等,发挥抗衰老抗氧化作用。已有实验 VitminE 具有抗光老化的作用 。β 胡 萝卜素是 VitminA的前体,能与细胞膜脂质双分子层结合能保护细胞免受细胞内外自由基 的损伤。 3. 本研究的目的和意义 近年来,大气层的臭氧空洞越来越多,到达地面的紫外线也在逐渐增加,人类皮肤癌 的发病率也在逐年上升,光老化更是广大人民群众关心的问题,科学家认识UVA对人类皮 肤也具有损伤作用,且比UVB的损伤更深;因此寻找更好的抗氧化、抗光老化的研究是目 前众多科学家的研究目的。干细胞是这个世纪以来的研究热点,研究表明,干细胞具有修 复受伤组织的作用,更有研究表明干细胞的修复作用是其分泌机制所引导的,已有研究利 用特定的诱导条件体外诱导干细胞分泌上清用于治疗,但是这种条件培养基是应用特定的 细胞因子诱导干细胞分泌某些特定的因子从而达到治疗的效果,细胞因子本身就价格昂 贵,使干细胞应用于临床治疗的医疗费用异常增高。本实验采用无血清培养基培养人脐带 间充质干细胞以获得干细胞分泌的细胞因子,并用于研究其抗皮肤光老化,取得实验结果 表明,干细胞无血清培养上清对紫外线引起的皮肤光老化具有良好的保护作用。 4.研究创新点: 1.目前虽然干细胞与再生医学研究很热,但是至今未查到应用人脐带间充质 干细胞抗 皮肤光老化的研究报导。 2.已有利用干细胞条件培养基中细胞因子研究的报导,但是这种条件培养基均是利用 昂贵的细胞因子在某种特定的环境下,诱导干细胞分泌所生成,静置培养干细胞所得的无 血清上清用于保护 HDF细胞,抗氧化、抗皮肤光老化实验,国内外都未见有报导。 9 暨南大学硕士学位论文 5.实验技术路线 本研究主要包括4个方面的内容:1.人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、人真皮成纤维 细胞(HDF)的分离培养及鉴定。 2.干细胞分泌无血清上清的收集及 USFM 的制备, USFM 对HDF细胞生长的影响。3.建立UVA损伤HDF细胞模型,USFM 预处理HDF细胞,再UVA 损伤,流式细胞术测量细胞凋亡状况,生化测定细胞内抗氧化酶活性的变化。4.模拟日光 紫外线辐射,建立昆明小鼠皮肤光老化模型;病理组织切片观察小鼠皮肤光老化的病理变 化,生化测定皮肤光老化后,小鼠体内各抗氧化酶活性水平;外用USFM 预处理小鼠皮肤 光照部分,研究USFM是否具有抗光老化效果。天狼星红染色方法研究光老化 皮肤中胶原 纤维的变化情况。具体实验技术路线如下: 人脐带间充质干细胞的分离培养 HDF细胞的 分离培养 UC-MSCs-SFM 的制备UVA损伤 UC-MSCs-SFM 对 HDF细胞 UC-MSCs- 昆明 细胞模型 UVA损伤的保护作用 SFM 对 小鼠UVA+UV 光老B 损伤小 化模 流式细胞术检测 生化测定细胞内 鼠皮肤的 型建细胞凋亡状况 抗氧化酶活性 保护作用 立 生化测定小鼠体 组织切片观察小鼠皮肤变化 内抗氧化酶活性HE染色观察小鼠 天狼星红染色观察皮肤中 I、皮肤结构变 化 ?型胶原纤维变化 实验技术路线图 10 暨南大学硕士学位论文 第二章 USFM的制备及促 HDF细胞生长评价 1.实验材料及试剂: 足月产新鲜婴儿脐带:暨南大学附属第一医院华侨医院妇产科提供。 胎牛血清(FBS)O Invitrogen Corporation 产品。 高糖 DMEM/F12 培养基:GIBCO Invitrogen Corporation 产品。取一袋培养 基干粉末, 三次蒸馏水定容至 1000ml。0.22μm 膜过滤除菌。使用时加入青霉素和链 霉素至终浓度为 100U/ml,加入 FBS至终浓度为 10%即为完全培养基。 PBS溶液:Na HPO ?2H O 1.56g,KH PO 0.20g,NaCl 8.00g,KCl 0.20g,三次 蒸馏 2 4 2 2 4 水定容至 1000ml。高温高压(121?、20min)灭菌,4?保存备用。 细胞消化液: 0.25g 胰蛋白酶(碧云天生物技术研究所)溶于 100ml PBS中, 加入 0.02g Na EDTA,4?溶解过夜,0.22μm膜过滤除菌,分装冷冻保存备用。 2 MTT试剂:美国 SIGMA 公司 二甲基亚枫(DMSO):美国 SIGMA 公司 NaHCO :广州化学试剂厂 3 NaCl:广州化学试剂厂 Na HPO :广州化学试剂厂 2 4 KH PO :广州化学试剂厂 2 4 KCl:广州化学试剂厂 青霉素钠:华北制药股份有限公司 硫酸链霉素:华北制药股份有限公司 2 主要仪器 CKX41 型倒置显微镜:日本 OLYMPUS公司制造。 MCO-15AC型二氧化碳培养箱:日本三洋公司制造。 SW-CJ-1F 型超净工作台:苏州净化设备有限公司制造。 超滤浓缩膜包:Sartorious 3KD 超滤浓缩膜包(vivaflow 50) 外科手术器械:上海手术器械厂 酶标自动读数仪:美国 BIO-RAD 11 暨南大学硕士学位论文 高压灭菌锅:日本 SANYO 3 实验方法 3.1 人脐带间充质干细胞、真皮成纤维细胞的分离培养 新鲜人脐带由暨南大学附属第一医院广州华侨医院妇产科提供。无菌条件取足月产的 婴儿脐带 5~10cm ,D-Hanks 液洗干净至组织无血色,去除表皮、两条动脉血管及一条静 3 脉血管,将组织剪碎至大约 1mm /块,加入含 10%FBS的 DMEM/F12培养基(含双抗), 37?、饱和湿度 、5%CO 培养大约一个星期,即可得到原代人脐带间充质干细胞。细胞 2 融合度 80%时,0.25%的胰蛋白酶(含 0.02%EDTA)消化细胞传代培养,取第 3 代~第 30 [52,53] 代的细胞实验 。 新鲜人的包皮组织由暨南大学附属第一医院广州华侨医院外科手术室提供。无菌条件 下取男性青年做包皮环切手术的包皮组织一块,D-Hanks 液洗干净取组织无血色,0.25% 3 的胰蛋白酶 4?消化组织 24h,去除表皮和皮下脂肪组织,留真皮层组织剪碎至大约 1mm / 块,加入含 10%FBS 的 1640 培养基(含双抗),37?、饱和湿度 、5%CO 培养大约一个 2 星期,即可得到原代人真皮成纤维细胞。细胞融合度 80%时,0.25%的胰蛋白酶(含 [54] 0.02%EDTA)消化细胞传代培养,取第 3代~第 5代的细胞实验 。 3.2 USFM 的制备 3.2.1 干细胞静置条件下收集培养上清 取第 3 代至第 30 代的干细胞,当细胞融合度 80%时,弃含 10%FBS 的培养基上清, PBS(pH7.0)洗涤细胞三次,加入无血清的 DMEM/F12 培养基继续培养 72 小时,收集 无血清培养基。分别取第 3 代、第 8 代、第 20 代、第 30代干细胞无血清培养上清测定其 促进 HDF 细胞增殖活性。 [55] 3.2.2 机械摩擦诱导干细胞分泌收集培养上清 分别取第 3 代、第 8 代、第 20 代、第 30 代干细胞, DMEM/F12(含 10% FBS)培 养基培养细胞,当细胞融合度 80%时,弃含 10%FBS的培养基上清,PBS(pH7.0)洗涤 细胞三次,用灭菌好的 Tips 在细胞表面来回摩擦损伤细胞,加入加入无血清的 DMEM/F12 培养基继续培养 72小时,收集无血清培养基。 12 暨南大学硕士学位论文 3.2.3 紫外照射诱导干细胞分泌收集培养上清