不同产地血竭凝血和抗血小板聚集作用的比较

不同产地血竭凝血和抗血小板聚集作用的比较 不同产地血竭凝血和抗血小板聚集作用的 比较 【摘要】  目的 考察不同产地血竭在凝血和抗血小板 聚集方面的作用。方法 采用毛细血管法测定凝血时间～体 内血小板致聚剂——胶原和肾上腺素诱导小鼠血瘀模型。结 果 不同产地血竭对正常小鼠的凝血功能均有一定的抑制作 用～可较明显抑制小鼠对血小板致聚剂诱发的血小板聚集作 用。结论 国产血竭和进口血竭均有一定的活血化瘀和抗血 栓形成的作用。 【关键词】  血竭,凝血时间,血小板致聚剂 Abstract:Objective To assess the activity in blood clotting and antiplatelet aggregation of dragon blood from different habitats(Methods Capillary method was used to get clotting time and congestive mice model induced with collagen protein and epinephrine hydrochloride was used(Results Dragon blood from different habitats have some inhibitory actions on blood clotting of healthy Kunming mice～platelet aggregation induced by platelet activation was also inhibited obviously(Conclusion Dragon bloods from China and abroad have some effects on promoting blood circulation～removing blood stasis and anti-thrombosis( Key words:Dragon blood,clotting time(CT),platelet aggregation 血竭,dragon blood,是珍贵的中药传统品种之一～主要来源于棕榈科麒麟竭及百合龙血树属龙血竭～进口的血竭主要为棕榈科麒麟血竭。国产龙血竭与进口棕榈科的血竭相比～在化学成分上有较大差异～国产血竭对血液系统、心血管系统有较强的药理作用,1-3, 。本研究的目的是以凝血时间和抗血小板聚集反应为指标～比较不同产地血竭凝血和抗血小板聚集作用～为进一步研究国产血竭替代进口血竭在血液方面的作用机制提供理论依据。 1  实验材料 1.1  药品与试剂 广西、云南、印尼、龙王、柬龙5种产地血竭原料～购于市场～由广东药学院药科学院天然药物化学教研室吕华冲副教授鉴定～自处理:用95%乙醇索式提取～所得醇溶物干燥～按血竭醇溶物?泊洛沙姆? 聚乙二醇4 000,质量比为1?2?1,～乙醇溶剂熔融法制备成固体分散体, 地奥心血康～成都地奥制药集团有限公司～批号060611, 复方丹参片～广州白云山和记黄埔中药有限公司,原广州白云山中药厂,～批号20051025, 盐酸肾上腺素注射液～北京市永康药业有限公司1 mL?1 mg～批号05100241, I型胶原蛋白～Northington Biochemical Corporation公司～1 g分装～批号35E8048。 1.2  动物   昆明小鼠～SPF级～雄性～体质量18，22 g～购于广东省实验动物中心～合格证号2006A017。 1.3  仪器 上皿电子天平FA2104,上海精密科学仪器有限公司,,钻石牌机械秒,上海星钻秒表有限公司,,电动玻璃匀浆机DY89-1型,宁波新之生物科技股份有限公司,。 1.4  药品、试剂的前处理与配制 血竭溶液:分别称取广西、云南、印尼、龙王、柬龙血竭固体分散体各10 g～再分别称取广西、印尼血竭固体分散体各5 g和2.5 g～共9份～分别加100 mL注射用0.9% NaCl研磨均匀～即得9种不同类型和剂量的血竭溶液。 复方丹参片溶液:复方丹参片3片加20 mL注射用0.9% NaCl研磨均匀～即得15 mg/mL丹参混悬液, 地奥心血康溶液:地奥心血康胶囊10粒加100 mL注射用0.9% NaCl研磨均匀～即得甾体总皂甙10 mg/mL地奥混悬液。 血小板聚集诱导剂溶液:精密称取?型胶原0 1 mg～加入75 mL的生理盐水～用电动匀浆机冰浴下匀浆4 h～再静臵冷藏2 d～临用前1 d～加入20 mL盐酸肾上腺素注射液～摇匀～定容到100 mL～冰箱4 ?冷藏,避光保存备用。 2  方法 2.1  毛细管法测定血液凝聚时间,自改良, 昆明小鼠192只～?～按体质量分类、随机分组～每组16只～分为NS组、阳性对照组,复方丹参片组0.3 g/kg、地奥心血康胶囊组0.2 g/kg,、不同产地龙血竭固体分散体组,广西血竭组分为0.5 g/kg、1 0 g/kg、2.0 g/kg低中高三组～印尼血竭组分为0 5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg低中高三组～云南组2 0 g/kg～龙王血竭组2.0 g/kg～柬龙血竭组2.0 g/kg,;实验设计空白对照组给予0.9%氯化钠溶液～每天按体质量灌胃给药1次～连续给药7 d。 末次给药1.5 h后～在17 ?的空调房间内～用毛细管插入小鼠眼底静脉丛取血～深约4，5 mm～轻轻转动～自血液流入管内按动秒表、开始计时～血液注满后取出毛细管平放于水平台面～每隔10 s向两侧倾斜一次～观察血液流动性～出现血液不再流动的时间,4, 。 2.2  药物对胶原蛋白和肾上腺素诱导血瘀模型小鼠的保护作用,5, 昆明小鼠240只～?～按体质量分类,随机分组～每组20只～分组同2.1～每天按体质量给药～连续给药7 d。 末次给药1.5 h后～小鼠尾静脉注射胶原蛋白和肾上腺素的混合诱导剂～诱发动物血栓性偏瘫甚至死亡～记录注射后10 min内小鼠死亡数～计算恢复率以及存活时间。小鼠10 min内存活计为恢复～恢复率=每组恢复动物数/每组动物数〓100% ,6～7, ～存活时间?10 min的～统一记录存活时间为10 min。 2.3  统计学处理 凝血时间数据以,〒s,表示～用单因素方差分析,SAS统计软件～version 9.0,～以P,0.05为差异有显著性,每组动物恢复数进行χ2检验～ 组间差异采用两两组间χ2检验,SAS统计软件～version 9.0,～以P,0.05为差异有显著性,存活时间先进行F检验 1～检验方差齐性～再进行t检验。 3  结果 3.1  不同产地血竭制剂对小鼠凝血时间的影响 经单因素方差分析～各给药组与空白组比较差异均有显著性(P,0.01),给药组间进行比较～地奥心血康组、广西高剂量组、印尼中剂量组和高剂量组可较明显延长小鼠的凝血时间～印尼中剂量和高剂量组作用最强～此两组差异无显著性(P,0.05)～其余给药组差异无显著性 (P,0.05)。由实验结果可知～广西和印尼血竭的延长凝血时间作用似有浓度相关性～印尼1 g/kg组为有效浓度。复方丹参片～作为临床的常用活血化瘀药～延长凝血时间方面的作用并不很强。地奥心血康可较明显延长小鼠凝血时间～但与印尼组相比差异无显著性。见表1。 表1  不同产地血竭对正常昆明小鼠凝血时间的影响,略, Tab.1  Effect of Dragon blood from different habitats on the clotting time of KM mice with capillary test  与空白对照组比较:*P,0.01 3.2  不同产地血竭对血栓形成小鼠存活时间的影响 每组恢复动物数进行χ2检验～χ2=24.6257～P,0.05～不同给药组对血栓形成小鼠存活率差异有显著性。 两两组间χ2检验～P,0.05～提示广西与印尼血竭的效果似无浓度相关性～各浓度组组间差异无显著性,广西和印尼的高剂量组、云南组、龙王组、柬龙组4组组间对小鼠存活率的改善作用差异无显著性～相比较而言～广西和印尼的低剂量组、云南组同丹参组、地奥组有较好的提高小鼠存活率的作用～龙王和柬龙组对小鼠存活率的改善作用比丹参组、地奥组差～差异有显著性。 存活时间先进行F检验～组间方差齐性～给药组与空白组经t检验～给药组能明显提高小鼠的存活时间,给药各组对提高小鼠存活时间的作用差异无显著性 (P,0.05)。结果见表2。 表2  不同产地血竭对血栓形成昆明小鼠存活 时间的影响,略, Tab.2  Effects of Dragon blood from different habitats on the living time of congestive mice induced with collagen protein and epinephrine hydrochloride 与空白对照组比较:*P,0.01 4  讨论 毛细管测定凝血时间法是一种经典的血液、心血管作 用药物有效性的初筛方法～具有操作简单、无设备性要求的 优点,4, 。本研究在此经典方法上稍作改进～以观察毛细 管中血液流动性为凝血的观测指标～当发生流动性减慢时～ 毛细管中的某一区段可能先有凝血小栓形成～采用此法比原 先的经典观察法——折断毛细血管观察血凝丝～可更有效地 减少实验中的人为操作误差和环境误差～避免毛细管中某一 小段区域先发生了凝血而在折断毛细管的过程中未观察到～ 提高了实验数据的可靠性和均一性。 胶原和肾上腺素致血瘀模型是中医学上常用的致血 小板聚集血栓栓塞模型～胶原可以激活血小板膜上磷脂酶A2～加速磷脂水解释放花生四烯酸～花生四烯酸在环氧酶以及进一步血栓烷A2合成酶的作用下转化为血栓素A2,TXA2,～促进血小板聚集～肾上腺素兼有α受体和β受体的激动作用～其激动α受体可引起皮肤、黏膜、内脏血管收缩～其激动β受体可引起骨骼肌和心肌兴奋、心率加快等作用～故胶原和肾上腺素合用具有增强致血小板聚集的协同作用。 我国的血竭长期以来主要靠进口～国产血竭为血竭资源的开发利用开辟了前景。本实验研究表明:不同产地血竭可明显延长正常小鼠凝血时间～血液状态明显比正常组颜色更鲜红。国产血竭有与进口血竭近似的活血作用。对正常小鼠凝血时间的改变作用～不同产地血竭有差异～广西血竭与印尼血竭延长凝血时间(CT)的作用相对最强～这与胡海燕等人的报道不同,8,。对胶原与肾上腺素合用致血栓栓塞小鼠的保护作用～不同产地血竭没有差异～广西和云南血竭在保护血小板致聚剂诱导血栓形成小鼠的方面的作用相对比较强。且广西和印尼血竭作用效果似没有浓度相关性。广西和云南血竭作为国内主要的血竭资源～是否可以完全代替印尼血竭以及深入探讨血竭的活血作用机制～还需要进一步的实验研究。 【参考文献】   ,1, 苏健～王宝琴～韩敏彩～等(进口与国产血竭含量测定方法研究进展,J,(中国中医药信息杂志～ 2005～12(1):49( ,2,朱华～黄海滨～田辉国(产血竭的化学成分研究概况,J,(广西中医学院学报～2002～5(4):90( ,3,向金莲～程睿～张路晗(血竭的活血和止血作用研究,J,(华西药学杂志～2000～15(6):433( ,4,徐叔云(药理实验方法学,M,(北京:人民卫生出版社1982:722( ,5,李仪奎～王钦茂～王惠康～等(中药药理实验方法学,M,(上海:科学技术出版社～1991:81( ,6,彭蕴茹～姜洁～沈鸿～等(银杏叶提取物活血通络作用的药效学研究,J,(中国药科大学学报～2003～34(6): 558( ,7,孙振球～医学统计学,M,.3版(北京:人民卫 生出版社～2002:51-70( ,8,胡海燕～黎 颖～杨得坡～等(不同粒径血竭粉末与制剂滴丸止血作用比较研究,J,(中国中药杂志～2004～29(12):1114-1143(